Značenje i uporabna vrijednost trombocitnih pokazatelja
Važnost broja trombocita u cirkulaciji proizlazi iz njihove višestruke uloge u procesu hemostaze. Rutinska pretraga kompletne krvne slike danas uključuje osim broja trombocita i trombocitne pokazatelje (indekse) te grafički prikaz njihove raspodjele po volumenu. To je omogućila automatizacija hematoloških laboratorija, a posebno uvođenje računala u sustave hematoloških brojača. Mogućnost različitog pristupa matematičkog izračuna trombocitnih pokazatelja dovela je do njihove velike varijabilnosti kod različitih tipova brojača. Ova varijabilnost jedan je od razloga koji su trombocitne pokazatelje gotovo eliminirali iz uporabe od strane kliničara. Drugi razlozi su nejasna definiranost, kao i njihova nedostatna ispitanost u različitim bolesnim stanjima.Opisani su najčešći trombocitni pokazatelji: broj trombocita (Tr, Plt), srednji volumen trombocita (MPV), trombokrit (Pct) i širina krivulje raspodjele po volumenu (PDW). Uz definiciju i način računanja kod pojedinih tipova brojača nazanačena su i ispitana bolesna stanja u kojima se značajno mijenjaju. Novija ispitivanja pokazuju pokušaj smanjivanja varijabilnosti uvođenjem novih trombocitnih pokazatelja. Oni znače razliku između izmjerene i očekivane vrijednosti. Nazivu je dodan podnaziv "ostatni" (prije svega PDW
Prikazana je i krivulja raspodjele trombocita po volumenu, njezino značenje i slučajevi u kojima značajno odstupa od normalne raspodjele. Izgled krivulje upućuje i na eventualnu prisutnost tehničke pogreške ili interferencije, što je važno za analitičare kako bi ih uklonili i izdali sa sigurnošću točan nalaz.
Svi ovi napori i ispitivanja usmjereni su jasnom definiranju uporabne vrijednosti trombocitnih pokazatelja. Kao parametri koji se dobivaju rutinskom analizom krvi, jednostavno i brzo mogu dati smjernice analitičaru (uklanjanje mogućih pogrešaka i interferencija) i kliničaru (potvrda radne dijagnoze ili smjernice za daljnju, specifičniju dijagnostiku).
UVOD
Zadnjih deset godina velikom se brzinom razvila automatizacija u hematološkom laboratoriju kao posljedica novih tehnologija u elektronici.
Revoluciju i nagli razvitak u automatizaciji, kao i nove pokazatelje krvne slike donijeli su mikroprocesori i računala koji su postali sastavni dio hematološkog brojača. S jedne strane, automatski upravljaju i kontroliraju radni proces, korigiraju moguće analitičke pogreške u tijeku mjerenja a, s druge strane, matematički i statistički obrađuju izmjerene pokazatelje. Na taj način su hematološki brojači "prerasli" u hematološke analizatore koji uz hematološke pokazatelje daju i diferencijalnu krvnu sliku s manje ili više podataka (1). Nova generacija hematoloških analizatora omogućuje brojenje i analizu trombocita i retikulocita.
Cilj je ogleda pregled najčešćih trombocitnih pokazatelja, njihovo značenje i uporabna vrijednost. Trebao bi imati za svrhu pomoć osoblju koje tehnički izvodi analize te kliničaru koji te analize rabi u dijagnostici poremećaja broja i morfologije trombocita.
OSNOVE ODREIVANJA BROJA I VOLUMENA TROMBOCITA
Načelo mjerenja trombocita hematoloških analizatora temelji se na dva osnovna principa:
a) mjerenje električnog otpora - impendancije
b) mjerenje s pomoću laserske zrake.
Oba principa podrazumijevaju transformaciju stanica u sferični oblik, a da se pri tome ne promijeni volumen stanice. To se postiže s pomoću reagensa za razrjeđivanje uzorka krvi, a predstavlja izotoničnu otopinu elektrolita precizne i propisane pH-vrijednosti (1).
a) Mjerenje električnog otpora vezano je uz brojenje impulsa nastalih prolaskom stanica kroz kalibrirane mikrootvore. Uzorak razrijeđen u elektrolitnom diluentu (strogo definirane provodljivosti i pH) usisava se u otvor između dviju elektroda. Prolaskom stanice, otpor se mijenja proporcionalno volumenu stanice. To se očituje pojavom impulsa određene veličine. Mikroprocesor broji i razvrstava ove impulse po veličini (ili volumenu - površini ispod impulsa) (slika 1).
Temelj je u Ohmovu zakonu: U = R x I. Budući da je struja jakosti I konstantna, otpor (R) raste sa svakim prolaskom stanice kroz mikrootvor, a proporcionalno s veličinom (volumenom) stanice i napon (U) (1, 2).
Ovaj je princip je patentirala tvrtka Coulter Electronics pedesetih godina te se u literaturi može naći pod imenom Coulterov princip (1).
b) Mjerenje s pomoću laserske zrake
Bez obzira na princip određivanja, krajnja izmjerena veličina je električni impuls različite veličine.
Visinu impulsa ili integriranu površinu unutar impulsa registrira mikroprocesor. On ih svrstava u određeni broj kanala. Broj kanala za trombocite je 64. Taj se broj može razlikovati kod različitih brojača. Na taj način dobiva se slika histograma ili krivulje raspodjele po volumenu ukupno izbrojenih trombocita unutar granica osjetljivosti.
GRANICE OSJETLJIVOSTI I INTERFERENCIJE
Granice osjetljivosti također se razlikuju kod različitih tipova brojača, a temelje se na statističkom zaključku najprihvatljivijeg volumena trombocita. Pozadina statističkog zaključka je obrada i mogućnost uklanjanja interferencija (slika 2) (3).
Kako pokazuje slika 2. u području do 2 fl moguće su interferencije ostataka stanica nastalih prilikom razrjeđivanja uzorka elektrolitnom otopinom za razrjeđivanje uzorka. Na taj način postavljena je donja granica osjetljivosti. Jednaka je kod svih hematoloških brojača.
Gornja granica osjetljivosti različita je a kreće se od 20 do 33 fl. U ovom području moguće su interferencije malih eritrocita (mikrocita) i/ili agregati trombocita. Osim toga, tu se nalaze i veliki trombociti - makrotrombociti.
Prisutnost malih eritrocita najčešća je interferencija, a krivulja raspodjele po volumenu tada izgleda kako pokazuje primjer na slici 3. Ovisno o tipu brojača i gornjoj granici osjetljivosti ovisi hoće li dio malih eritrocita biti izbrojen kao trombociti. Brojači sa gornjom granicom osjetljivosti od 20 fl neće uključiti ovu interferenciju. Međutim, može se dogoditi da eventualno prisutni makrotrombociti nisu uključeni u broj trombocita. Za razliku od toga, brojači s gornjom granicom od 30 fl izbrojit će dio mikrocita kao trombocite, ali i eventualno prisutne makrotrombocite. Ako su interferencije uključene u ukupan broj trombocita, tada stvaran broj trombocita treba odrediti referentnom metodom brojenja pod mikroskopom (po Rees-Ecker-u).
Neki noviji brojači - analizatori imaju mogućnost uklanjanja ovih interferencija tzv. VCS tehnologijom (npr. Coulter STKS: brojenje uz diskriminaciju mikroeritrocita i makrotrombocita na osnovi VCS tehnologije) ili ponovnim brojenjem uz pomak granice osjetljivosti (npr. SEAC Genius) (slika 4). Ovaj pomak gornje granice osjetljivosti može biti ili automatski ili manualni.
VCS tehnologija temelji se na istodobno tri nezavisne tehnologije. Volumen stanica određuje se na osnovi Coulterova principa. Neprozirnost (stanični sadržaj) određuje se na osnovi vodljivosti stanice pomoću visokofrekventne elektromagnetske sonde. Na taj se način eliminiraju oni volumeni - impulsi koji značajno odstupaju od određenih. Karakteristika površine stanice, morfologija i granulacija određuje se laserskim svjetlom.
Na osnovi ove trodimenzionalne analize dobivamo kompletnu studiju karakteristike svake pojedine stanice za točno klasificiranje i brojenje normalnih i abnormalnih populacija stanica (veliki i mali trombociti, nakupine trombocita, mikro eritrocita, a osobito je prikladna za diferenciranje bijelih krvnih stanica).
NAJČE[ĆI TROMBOCITNI POKAZATELJI I NJIHOVO ZNAČENJE
Volumen i broj trombocita su mjere koje su direktno izmjerene brojačem. Ostali trombocitni pokazatelji dobivaju se matematičkim postupcima. U različitim odnosima izmjerenih vrijednosti mogu se dobiti različiti pokazatelji i indeksi koji bi trebali dati jasniju sliku značajnih odstupanja od normalne populacije trombocita. Ova odstupanja vezana su za promjene i poremećaje njihova broja i volumena. Na taj način trebala bi biti pomoć u diferencijalnoj dijagnostici trombocitopenija i trombocitoza.
Najčešći trombocitni pokazatelji su: MPV (srednji volumen trombocita), PCT (trombokrit) i PDW (širina krivulje raspodjele trombocita po volumenu).
Postoje i drugi matematički pokazatelji vezani uz trombocite, npr.: P-LCR (Sysmex K-4500) (udio velikih trombocita u izbrojenoj populaciji trombocita pri čemu je to, matematički gledano, površina ispod krivulje raspodjele u rasponu od 12 do 30 fl) (8); MPC i MPM (Advia 120, Bayer) (10). I. Tr - Trombociti (ili Plt - Platelet)
Broj trombocita je vrijednost koja predstavlja apsolutni broj cirkulirajućih trombocita određen bilo kojim principom određivanja. 2/3 ukupnih trombocita u organizmu nalazi se u cirkulaciji, a približno 1/3 nalazi se u slezeni. Izražava se na jedinicu volumena krvi (broj x 10<Č>9<Č*>/L), a normalne vrijednosti kreću se od 140 do 425 x 10<Č>9<Č*>/L i ne ovise o dobi i spolu. Nešto niže vrijednosti mogu se naći u prvih nekoliko dana života, a nakon toga dostižu vrijednosti odraslih. Osim toga pokazuju najmanju varijabilnost s obzirom na metode određivanja i tip hematološkog brojača. Najvažnija funkcija trombocita je sudjelovanje u procesu hemostaze i to na nekoliko načina i na različitim razinama:- oslobađanje vazokonstrikcijskih tvari (serotonin, tromboksan A
agregacijom na oštećenome mjestu omogućuju stvaranje trombocitnog čepa
u dodiru s oštećenim tkivom oslobađaju fosfolipide (trombocitni faktor 3) koji sudjeluje u unutrašnjem putu zgrušavanja
na njihovoj se površini protrombin pretvara u trombin
potrebni su u retrakciji ugruška
poremećaj trombocita izazivaju sklonost krvarenju
poremećaji mogu biti: kvantitativni i kvalitativni (trombocitopatije)
kvantitativni poremećaji< mogu biti:
smanjenje broja cirkulirajućih trombocita ispod 100 x 10<Č>9<Č*>/L (TROMBOCITOPENIJA)
povećanje broja cirkulirajućih
Tablice 1. i 2. prikazuju poremećaje trombocita te bolesti i stanja koja značajno snizuju ili povećavaju njihov broj. U oba slučaja postoji sklonost krvarenju.
II. MPV - srednji volumen trombocita
Ova vrijednost izražena je u femtolitrima (fl) a dobivena je direktno iz krivulje raspodjele po volumenu ili izračunavanjem srednje vrijednosti svih volumena u izbrojenoj populaciji trombocita. Važno je napomenuti da se MPV mijenja 1 sat nakon uzimanja uzorka krvi i to za približno 20%, a nastaje kao rezultat interakcija između EDTA i sniženja temperature (od 37<Ž176>
Poznata je varijabilnost volumena (veličine) trombocita u usporedbi s brojem trombocita i normalno postoji inverzni odnos broja i veličine: povećani volumen prati sniženi broj trombocita. Ovaj odnos prikazan je nomogramom (Bassman) (3) na slici 5. Nomogram pokazuje da je MPV između 9 do 9.9 fl normalno područje volumena za sve trombocite koji su u normalnom rasponu vrijednosti za broj trombocita. MPV od 7.8 do 8.9 fl ili 9.9 do 12.0 fl može biti ili ne mora u normalnom rasponu. To ovisi o broju trombocita.
Odstupanja MPV vrijednosti od normalnog raspona nalaze se u različitim bolesnim stanjima (3):
MPV
mijeloproliferativne bolesti (mijelofibroza)
idiopatska trombocitopenična purpura
splenektomija
kronična mijeloična leukemija anemija
MPV
hipersplenizam
stanja poslije kemoterapije
aplastična anemija
megaloblastična anemija
Wiskott-Aldrichev sindrom
Tako se npr. MPV kao trombocitni
pokazatelj može upotrijebiti za procjenu uzroka trombocitopenija. Veliki, makrotrombociti (koje prati povišena vrijednost MPV-a) prisutni su kada je produkcija trombocita abnormalna (u nekim kongenitalnim sindromima) ili npr. u autoimunoj trombocitopeničnoj purpuri gdje je produkcija povećana zbog povećane potrošnje. Mali trombociti (MPV je snižen) karakteristični su za trombocitopenije uzrokovane greškom u koštanoj srži. Kod trombocitoza u mijeloproliferativnim bolestima povišen je MPV, kao i PDW, za razliku od reaktivnih trombocitoza gdje su MPV i PDW normalni (10).
III. Tct - TROMBOKRIT
(ili Plateletcrit - Pct)
Trombokrit (Tct) je trombocitni pokazatelj koji predstavlja volumni % trombocita, odnosno omjer ukupnog volumena trombocita (iz histograma) i volumena aspiriranog uzorka pune krvi (7). Određuje se isključivo matematički preko PDW-a ili preko MTV-a:
Pct (%) = indeks raspodjele Tr (PDW) x Tr (4)
Normalne vrijednosti kreću se od 0,150 do 0,320%, a razlikuju se kod različitih tipova brojača. To ovisi o tome kako se računa i koje su normalne vrijednosti pokazatelja preko kojih se računa. Kao trombocitni pokazatelj nije prisutan kod svih analizatora (brojača). Dijagnostičku vrijednost tog pokazatelja tek treba dokazati.
IV. PDW - Platelet distribution width
- indeks raspodjele trombocita po volumenu
Ovaj trombocitni pokazatelj dobiva se isključivo iz krivulje raspodjele trombocita po volumenu i predstavlja širinu te krivulje. Različiti hematološki brojači (analizatori) na različite načine definiraju tu širinu (slika 6). No, bez obzira na definiciju, svi predstavljaju
Slika 6. prikazuje prisutnu veliku varijabilnost PDW-a kod različitih tipova brojača i analizatora. Različito se računaju i definiraju. Različite su mjerne jedinice, kao i rasponi normalnih vrijednosti. To je jedan od razloga zbog kojeg kliničari ne nalaze uporabnu vrijednost ovog pokazatelja. Drugi je mogući razlog da se PDW može pretpostaviti iz MPV-a iako su MPV i PDW dvije nezavisne veličine. Kako je uporabna vrijednost PDW-a dosta nejasna te uz gore navedene razloge, noviji tipovi hematoloških analizatora više ne štampaju u završnom nalazu ovaj trombocitni indeks. Ipak, takvi analizatori imaju mogućnost njegova izračunavanja i mogu se dobiti u pregledu na monitoru računala. U zamjenu za ovaj trombocitni indeks neki analizatori daju na jednom prikazu raspodjele trombocita po volumenu i normalnu krivulju i izmjerenu krivulju. Tako se vizualno može uočiti eventualno značajno odstupanje od normalne raspodjele.
IZGLED I ZNAČENJE KRIVULJE RASPODJELE TROMBOCITA PO VOLUMENU
Normalna krivulja raspodjele trombocita po volumenu je ulijevo ukošena Gausova krivulja (slika 7). To znači da nema maksimum oko aritmetičke sredine volumena, već je pomaknuta više ulijevo. Druga važna značajka je da iznad 20 fl ima mali broj, tj. površina ispod krivulje je minimalna i kao takva ide do 70 fl gdje je gotovo nula (3).
Gledajući normalnu raspodjelu po volumenu, možemo zaključiti da je veći broj trombocita kao i srednja vrijednost volumena ispod 10 fl (cca 7 do 8 fl), da je manji dio trombocita po volumenu (a time i veličini ) veći, a oni predstavljaju "mlađe" trombocite.
Postoji li funkcionalna razlika između "mlađih" i "starijih" trombocita, nije utvrđeno. U literaturi postoje oprečna mišljenja o tome. Jedni smatraju da su mladi (veći) trombociti funkcionalno sposobniji od starih, što bi značilo da funkcija trombocita tijekom vremena u cirkulaciji slabi, dok drugi smatraju da je pojava većih i manjih trombocita posljedica heterogenosti veličine megakariocita i neovisna je o funkciji i vijeku samog trombocita (4).
Slika 8. a prikazuje izgled krivulje raspodjele trombocita po volumenu kada je prisutan nalaz dviju populacija trombocita, a slika 8. b postojanje multiplih populacija trombocita (4).
Sam izgled krivulje važan je te može poslužiti izvođaču analize u smislu možda prisutnih interferencija i njihovog uklanjanja, kao i moguće pogreške tehničkog izvođenja (neadekvatan antikoagulans, agregati trombocita, nedovoljno promiješan uzorak...). Neki primjeri izgleda krivulje kod tehničkih pogrešaka prikazani su na slici 9. (3, 5).
Ove tehničke pogreške upozoravaju analitičara da, ako je moguće, ukloni pogrešku iz istog uzorka, da ponovi brojenje iz novog uzorka, a ako ni to nije dostatno, trombocite treba izbrojiti referentnom metodom mikroskopskog brojenja.
NOVE STUDIJE O TROMBOCITNIM POKAZATELJIMA
Literaturni podaci govore o pokušaju uvođenja novog trombocitnog pokazatelja kojim bi se izbjegla ova varijabilnost određivanja, a istodobno bismo imali bolje mogućnosti u diferencijalnoj dijagnozi trombocitoza ili trombocitopenija (9).
Novi trombocitni pokazatelj nazvan je PDW
PDWostatni = PDWizmjereni - PDWočekivani
Na ovaj način dobiva se broj koji nam kazuje za koliko se krivulja raspodjele po volumenu izmjerene populacije trombocita razlikuje od krivulje raspodjele normalne (idealne) populacije trombocita. Normalni raspon vrijednosti za PDW
Postoji ideja da se analogno PDW-u uvedu novi pokazatelji i za MPV i za broj trombocita kao MPVostatni i Trostatni (9).
Ključne riječi:
Kategorija: Pregled
Broj: Vol. 43, No 2, travanj - lipanj 1999
Autori: J. Leniček Krleža, R. Zadro, M. Nakić
Referenca rada:
DOI: