Lažno negativna antiglijadinska i antiendomizijska antitijela kod izoliranog manjka u serumu

Prikazujemo dvoje djece u kojih je dijagnoza glutenske enteropatije postavljena na osnovi anamneze, biopsije sluznice jejunuma i kliničkog poboljšanja nakon uvođenja bezglutenske prehrane. U oboje je u serumu nađeno povišenje IgG-antiglijadinskih antitijela, dok su IgA antiglijadinska antitijela i antiendomizijska antitijela bila lažno negativna. Određivanje ukupnih IgA u serumu omogućuje pravilnu interpretaciju odsutnih IgA-antiglijadinskih i antiendomizijskih antitijela.
UVOD
Nakon prvog opisa Crabbea i Heremansa (1) o udruženosti steatoreje i izoliranog manjka imunoglobulina A (IgA) u serumu, u brojnim kasnijim istraživanjima potvrđena je povezanost glutenske enteropatije (GE) i selektivnog manjka IgA u serumu (2, 3). Po nekim autorima ova se povezanost može utvrditi u oko 3% bolesnika s GE, ali se pretpostavlja da je ona znatno češća (4).
Kao znak imunog odgovora, u serumu oboljelih od GE pojavljuju se antiglijadinska antitijela (AGA), ali i tkivna autoagresivna antitijela tipa antiendomizijskih (EMA) i antiretikulinskih antitijela (ARA) (5, 6). Primjena seroloških testova koji se temelje na dokazu spomenutih antitijela znatno je olakšala prepoznavanje i dijagnozu GE, osobito u bolesnika s pritajenim (silent) i latentnim oblicima bolesti (6).
Posljednjih su godina u literaturi objavljeni pojedinačni prikazi ili manje serije bolesnika s GE, koji nisu uvijek bili prepoznati na osnovi određivanja AGA i EMA u serumu (7, 8, 9, 10, 11, 12). I sami smo nedavno imali slično iskustvo s dvoje bolesnika, koji su predmetom ovog istraživanja.
METODE
Hematološke i biokemijske pretrage, kao i testovi apsorpcije, učinjeni su uobičajenim metodama u biokemijskom i hematološkom bolničkom laboratoriju. Razina ukupnih imunoglobulina u serumu razreda IgG, IgA i IgM određena je metodom imunodifuzije u agarskom gelu. Sniženi IgA u serumu definiran je koncentracijama manjim od 0,05 g/l (13). Koncentracija AGA u serumu razreda IgG i IgA određene su enzimsko-imunim esejem (ELISA), komercijalnim kitom (Alfa-glijatest, Eurospital, Trst, Italija). Optička gustoća izražena je u dogovornim jedinicama (U), kao postotak optičke gustoće pozitivnih kontrolnih seruma (13). EMA razreda IgA izmjerena su indirektnom imunofluorescencijom, komercijalnim kitom (Endomisio, Eurospital) koji za antigen rabi majmunski jednjak. Pojava svijetleće zelene mrežice pri imunofluorescentnoj mikroskopiji, nakon razrjeđenja seruma 1:5, smatrana je pozitivnim nalazom. Biopsija sluznice početnog jejunuma izvršena je Zahoreczovom sondom, a za analizu su uzimana najmanje dva uzorka biopta sluznice.
PRIKAZ BOLESNIKA
Djevojčica D. I. hospitalizirana je u studenome 1993. godine u dobi od 19 mjeseci zbog proljeva, povraćanja i inapetencije, a tjelesna težina pada s 11,5 kg na 7,85 kg u posljednja dva mjeseca. Dijete je kod prijma blijedo, neraspoloženo, prominentna abdomena, jasno hipotrofično i hipotonično, visine 0,79 m (25. c.), mase 7,8 kg (- 3,2 SD). Laboratorijski se nalazi hipokromna anemija s Hb 88 g/l, Fe u serumu 8,6 umol/l, feritin iznosi 1,5 ng/ml, a transferin 2,77 g/l. Jednosatna d-ksiloza snižena je i iznosi 1,13 mmol/l. Kvantitativno određivanje imunoglobulina u serumu pokazalo je odsutan IgA, uz normalne vrijednosti IgG (14,6 g/l) i IgM (0,86 g/l). Limfociti B iznose 0,336xl0<Č>9<Č*>/l, limfociti T 1,9x10<Č>9<Č*>/l, a test blastične transformacije mitogenima pokazao je također uredne nalaze. Biopsija sluznice jejunuma otkriva totalnu atrofiju (stupanj IV), a HLA-DNA analizom nalazimo prošireni podložni haplotip DRB1* 0301-DQA1* 0501-DQB1* 0201. Na prehrani bez glutena dolazi postepeno do prestanka povraćanja i proljeva, te potpunoga kliničkog oporavka. Rebiopsija crijeva u dobi od 3 godine i 3 mjeseca pokazala je uredan morfološki nalaz. Manjak IgA perzistira, IgG iznosi 14,8 g/l , a IgM 1,37 g/l.
Nekoliko tjedana nakon ponovnog uvođenja glutena (<Ž147>provokacija<Ž148>) dijete dobiva proljevaste stolice i majka samoinicijativno stavlja dijete na bezglutensku prehranu. Na posljednjoj kontroli u dobi od 4,5 godine dijete je visoko 1,04 m (25. c.), a masa iznosi 16,4 kg (50. c.). AGA i EMA uzeti su u aktivnoj fazi bolesti te nakon 11, odnosno 20 mjeseci od početka provođenja dijete bez glutena (tablica).
Dječak N. I., dob 35 mjeseci, primljen je u Kliniku u srpnju 1996. godine zbog promjene raspoloženja, inapetencije i upornoga povraćanja unatrag tri tjedna. Kod prijma visina iznosi 0,94 m (50. c.), težina 12,6 kg (-1,32 SD ), a klinički je nalaz bez osobitosti. Dijete je prvih dana na normalnoj prehrani, i dalje nakon obroka povrati te ima jednu ili dvije stolice na dan koje su ipak nešto obilnije i smrdljive. EEG i CT mozga bili su uredni, jednako kao i rendgenski pregled jednjaka, želuca i dvanaesnika. Nakon što se nađe niska d-ksiloza (0,72 mmol/l) i aplanirana krivulja laktoze, a biopsijom jejunuma hiperplastična atrofija crijevnih resica stavlja se na bezglutensku prehranu. Hematološki se nalazi hemoglobin od 90 g/l, serumsko željezo od 15,5 umol/l, transferin 3,27 g/l i feritin 4,0 ng/ml. Imunodifuzija otkriva nemjerljivo nizak IgA u serumu, uz normalne razine IgG (10,0 g/l) i IgM (0,8 g/l). HLA-DNA analizom ustanovi se postojanje tipičnog celijakičnog haplotipa : DRB1* 0301-DQA1* 0501-DQB1* 0201. Na prehrani bez glutena uočava se prestanak povraćanja već nakon nekoliko dana, a stolice se normaliziraju nakon dva tjedna. Apetit se vraća jednako kao i raspoloženje, uz postepeni napredak na težini. U skladu s revidiranim ESPGAN kriterijima (15) rebiopsija crijeva nije učinjena. Preporučena je trajna bezglutenska prehrana. Izolirani manjak IgA perzistira kod kontrole imunoglobulina u više navrata. Na posljednjem pregledu u dobi od pet godina dječak je visok 110 cm (50. c.) , a tjelesna masa iznosi 18 kg (50. c.). IgG iznosi 12,8 g/l, IgA je nemjerljivo nizak, a IgM iznosi 0,92 g/L.
AGA i EMA u serumu uzeti su kod dolaska, dva mjeseca od početka uvođenja bezglutenske dijete i u dobi od 4,5 godine u vrijeme nekontroliranog unosa glutena (tablica).
RASPRAVA
Imunološka zbivanja u bolesnika s GE očituju se pojavom AGA, ARA i EMA nakon izlaganja glutenu (5, 16). Povišena koncentracija u aktivnoj fazi bolesti i pad koncentracija nakon provođenja bezglutenske dijete, čvrsto podupiru dijagnozu GE (6, 15). Po svojoj prirodi AGA i ARA pripadaju razredima IgG i IgA, dok su EMA uglavnom razreda IgA. AGA su rezultat imune reakcije na razne frakcije glijadina (više od 40) u žitaricama koje, vjeruje se, intaktne ulaze u cirkulaciju (5).
ARA su u pravom smislu riječi autoantitijela, koja reagiraju s retikulinskim vlaknima vezivnog tkiva raznih organa štakora i ljudi (16). Treća grupa nedavno otkrivenih antitijela, EMA, jesu poput ARA tkivna autoantitijela uperena protiv intermiofibrilarne supstancije glatkih mišića, a reagiraju samo s endomizijem gastrointestinalnog trakta primata (16). Priroda endomizijskog antigena razjašnjena je 1997. dokazom tkivnih transglutaminaza kao specifičnog autoantigena (17).
Danas još ne postoji usklađeno mišljenje u pogledu pouzdanosti pojedinih razreda AGA u dijagnozi GE. Neki se oslanjaju na određivanje IgG-AGA, drugi su skloniji veću dijagnostičku vrijednost pripisati određivanju IgA-AGA, dok većina preferira istodobno određivanje obaju razreda AGA (6, 16, 8). Ako se kao referentna metoda uzme ELISA, u literaturi se mogu naći različiti podaci o osjetljivosti i specifičnosti pojedinih razreda AGA. Općenito uzevši IgG-AGA su osjetljiviji test (82-100%) nego IgA-AGA (52-99,9%), ali specifičnost ovih drugih (65-100%) nadmašuje one IgG-AGA (50-100%) (5, 16, 18). Danas je sasvim jasna činjenica da IgG-AGA nisu svojstvena samo oboljelima od GE, pa se mogu naći u povišenim koncentracijama (lažno pozitivni) u zdravih osoba, brojnim drugim gastrointestinalnim poremećajima i u genetski predeterminiranih, naoko zdravih osoba s urednim histološkim nalazom sluznice crijeva (latentna GE) (5, 19). Po nekim istraživačima, lažno pozitivna IgG-AGA mogu biti prisutna u čak 62% ispitanika (20), a njihova osjetljivost pada s rastućom dobi (5, 16).
Po svemu sudeći, tkivna autoantitijela, ARA i EMA, najvjerodostojniji su testovi za dokaz GE, s time da su EMA osjetljiviji test, bez žrtvovanja specifičnosti (5, 6, 16, 18, 21). Po recentnim istraživanjima, neki dovode u pitanje potrebu za biopsijom sluznice u EMA-pozitivnih bolesnika, ako su određena u referentnom laboratoriju, a klinička slika upućuje na postojanje GE (20).
U rijetkim okolnostima EMA mogu biti lažno pozitivna bilo da se radi o kontrolnim osobama ili pojedinačnim bolesnicima s alergijom na protein kravljeg mlijeka ili lamblijazom (5, 6, 16, 21). Naravno, jedan dio prividno zdravih EMA pozitivnih kontrola odnosi se na latentne oblike GE (21). Znatno češće kliničar će biti u prilici sresti se s lažno negativnim IgA-AGA i EMA u bolesnika s GE koji imaju pridruženi izolirani manjak IgA u serumu.
Izolirani manjak IgA u serumu najčešća je primarna imunodeficijencija s prevalencijom od 1 : 700 u općoj populaciji (13). Definira se kao sniženje IgA u serumu ispod 0,05 g/l, uz normalnu razinu IgG i IgM, uredan stanični imunitet i očuvanu sposobnost stvaranja non-IgA antitijela. Na molekularnom nivou poremećaj još nije sasvim razjašnjen, a uzrok se povezuje sa zastojem u diferenciranju B-stanica pod utjecajem gena HLA kompleksa (13). Manjak je najčešće potpun i zahvaća oba podrazreda (IgA1 i IgA2), i odnosi se istodobno na manjak monomera i dimera IgA koji se sintetizira u sluznici crijeva. Većina zahvaćenih osoba nema nikakvih simptoma, dok su drugi izloženi riziku autoimunih bolesti poput dijabetesa, Addisonove bolesti, reumatoidnog artritisa ili GE (12, 22). Učestalost IgA manjka u serumu kod oboljelih od GE procjenjuje se na oko 3%, s time da je rizik za GE u IgA-deficijentnih osoba deset puta češći nego u ostaloj općoj populaciji (23). <%10>Cataldo i su<%0>r. (21) procjenjuju da je relativni rizik pridruženog IgA manjka u GE (15, 8). Uzrok ove čvrste povezanosti nije sasvim jasan, ali se najčešće povezuje sa zajedničkim genetskim činiocima. Činjenica je kako i jedno i drugo stanje dijele zajedničke HLA-antigene, odnosno gene (24). Kao i u drugih (25) i u naše dvoje bolesnika s potpunim manjkom IgA u serumu prisutan je karakterističan celijakični produženi haplotip DRB1* 0301-DQA1* 0501-DQB1* 0201. Ranije, dok je dijagnoza GE počivala na apsorpcijskim testovima i višestrukim biopsijama jejunuma, manjak IgA u serumu nije utjecao na postavljanje dijagnoze. Danas, kada ona počiva i na serološkoj dijagnostici, temeljiti dijagnozu na određivanju IgA-AGA, EMA ili IgA-ARA, a bez poznavanja ukupnih IgA u serumu, riskiramo mogućnost postavljanja dijagnoze i GE i pridruženog selektivnog manjka IgA (5, 6). Po <%10>Rittmeyer<%0>u i <%10>Rhods<%0>u (8), do 1996. u literaturi je otkriveno sedam bolesnika s lažno negativnim IgA-EMA i pet njih s lažno negativnim IgA-AGA. Autori su literaturi dodali dva bolesnika s lažno negativnim IgA-AGA i EMA, koji su pravilno interpretirani naknadnom analizom imunoglobulina u serumu. Tijekom 1997. godine u literaturi smo otkrili još tri prikaza s ukupno 17 bolesnika s GE i pridruženim manjkom IgA u dječjoj dobi (9, 10, 11, 12), a tijekom 1998. godine i četiri odrasla bolesnika u izvještaju <%10>Sulkanena i su<%0>r. (26). Mi nismo imali teškoća u interpretaciji AGA i EMA u dvoje svojih bolesnika jer imunoglobuline u serumu rutinski uzimamo kod svakog djeteta sa sumnjom na malapsorpciju. Manjak IgA bio je potpun, a prisutan je i kod svih daljnjih kontrola tijekom praćenja. Zbog razvojne imunosne nezrelosti u prvim mjesecima i godinama života, razlikovanje između fiziološke i tranzitorne hipogamaglobulinemije neće uvijek biti jednostavno (27). Stoga prije interpretacije AGA i EMA uobičavamo u dvojbenim slučajevima, raspraviti s biokemičarem vjerodostojnost nalaza. [to se tiče same koncentracije IgA u serumu, patološkim smatramo vrijednosti koje su manje od 0,05 g/l, ali tek nakon navršene druge godine života te ako su koncentracije opetovano snižene pri kasnijim kontrolama.
Naše iskustvo ujedno upozorava na važnost istodobnog određivanja obaju razreda AGA (IgA i IgG) kod svakog djeteta sa sumnjom na GE, kako bismo mogli dijagnosticirati i relativno veliki postotak onih bolesnika s GE koji imaju pridruženi izolirani manjak IgA. Oba naša bolesnika imala su vrlo visoke IgG-AGA, što su uočili i drugi (7, 8, 9, 10, 11), ali ne i svi autori.Collin i sur. (23) nalaze da osjetljivost IgG-AGA u IgA-deficijentnih glutenskih enteropata iznosi svega 43%, pa se preporuča mjerenje IgG-ARA ili IgG-EMA za potvrdu dijagnoze. Kako je poznato iz literature (5, 6) bolesnici s GE i normalnom razinom imunoglobulina u serumu u aktivnoj bolesti imaju povišene koncentracije EMA na račun razreda IgA, a samo njih oko 15% ima povišene i IgG-EMA (7). U IgA- deficijentnih bolesnika dolazi do kompenzatornog povišenja IgG-EMA, što je od dijagnostičkog značenja u tim okolnostima. Mi u Hrvatskoj nemamo, na žalost, tu mogućnost, jednako kao ni određivanja IgG-ARA.
Danas još nemamo podataka koji je IgG test (AGA, EMA ili ARA) najosjetljiviji u IgA deficijentnih osoba, odnosno koja njihova kombinacija ima najveću dijagnostičku osjetljivost (28). Nedavno su <%10>Sulkanen i su<%0>r (26) izvijestili da IgG-EMA test, koji umjesto konvencionalnog antigena (majmunski ezofagus) rabi antigen humanog umbilikusa, vrlo pouzdano otkriva manjak IgA u bolesnika s GE.
U bolesnika s GE i normalnim imunoglobulinima u serumu, nakon uklanjanja glutena, dolazi do brzog pada IgA-EMA i IgA-AGA, dok će za normalizaciju IgG-AGA često trebati više mjeseci ili čak godina (5, 6, 21). [to se tiče dinamike kretanja koncentracije IgG-AGA kod bolesnika s manjkom IgA nakon uvođenja bezglutenske prehrane, podaci su vrlo oskudni i nedostaje dugoročno praćenje. Kao i drugi (9, 10), zabilježili smo značajan pad koncentracije IgG-AGA već nakon dva, odnosno jedanaest mjeseci od uvođenja bezglutenske prehrane. U jednog djeteta, nekontrolirani unos glutena, doveo je do ponovnog porasta koncentracija IgG-AGA u serumu, ali bez ikakva utjecaja na koncentracije IgA-AGA i IgA-EMA. U zaključku bismo istakli kako kliničar treba uvijek imati na umu visoku udruženost GE i selektivnog manjka IgA u serumu. Određivanje imunoglobulina u serumu treba rutinski uzeti prije određivanja AGA i EMA u serumu, a radi lakše interpretacije s nalazom treba upoznati laboratorij. U slučaju negativnih nalaza IgA-AGA i EMA, uz visoke IgG-AGA, treba zatražiti određivanje IgG-ARA ili IgG-EMA, ako takva mogućnost postoji.