Spontana prematurna kondenzacija kromosoma u djece s akutnom leukemijom

Ispitivanja spontane pojave prematurne kondenzacije kromosoma (PCC) u djece s malignom bolešću su oskudna. Nije poznata učestalost PCC-a i njegovo biološko i kliničko značenje. U ovom radu prikazujemo rezultate ispitivanja spontane pojave fuzijom-potaknute- PCC u 85-ero djece s akutnom leukemijom. Analiza je obavljena u vrijeme postavljanja dijagnoze na preparatima dobivenim 24-satnom kulturom stanica koštane srži i/ili periferne krvi bez stimulacije mitogenom. PCC je otkriven u 6-ero (7,1%) pacijenata, u 3-je (9,4%) od 32-je bolesnika s AML-om i u 3-je (5,7%) od 53-je djece s ALL-om (uključujući 3-je bolesnika s morfološki nediferenciranom leukemijom, i fenotipskim svojstvima ALL-a). Rezultati upućuju na to da PCC nije rijetka pojava u djece s hemoblastozama.
Ispitivanje, međutim, ne potvrđuje pretpostavku da je fenomen PCC jedan od mehanizama nastanka varijabilnosti genoma i evolucije tumorskog klona u djece s akutnom leukemijom. UVOD

Poznato je da su kromosomi dinamič ne strukture koje tijekom staničnog ciklusa mijenjaju stupanj spiralizacije. Kromosomi su despiralizirani tijekom interfaze, a proces spiralizacije započinje ulaskom stanice u mitozu. Spiralizacija kromosoma i stanična dioba strogo su kontrolirani procesi, jer osiguravaju podjednaku raspoređenost identičnih replika kromosoma u dvije novonastale stanice kćerke. Malo znamo, međutim, o mehanizmima spiralizacije i genetičkoj kontroli procesa te su ispitivanja od znanstvenog i praktičnog zanimanja (1). Prematurna kondenzacija kromosoma (PCC) ozna- čava poremećaj u procesu kondenzacije kromatina i spiralizaciju genoma u fazi staničnog ciklusa, kad su kromosomi despiralizirani i čine finu mrežicu unutar jezgrine membrane (2). Poremećaj kondenzacije kromatina može biti konstitucijski ili stečen, induciran ili spontan, te može biti posljedica stanične fuzije ili poremeć aja gena koji kontroliraju spiralizaciju kromatina i stanični ciklus (3-7).
N i t z e l i s u r . su 2002. godine opisali autosomno recesivan PCC sindrom _OMIM # 606858_ u dvoje djece s prematurnom kondenzacijom kromosoma, mikrocefalijom, niskim rastom i mentalnom retardacijom (3). Spontana pojava fuzijom-potaknutog-PCC-a opisana je u populaciji čovjekovih tumorskih stanica. PCC je posljedica fuzije dviju stanica od kojih je jedna stanica u metafazi, a druga u interfazi (4). Fuzijom stanica dolazi do morfoloških promjena genoma interfazne jezgre. Morfološki izgled prematurno kondenziranih kromosoma je varijabilan i ovisan je o stadiju staničnog ciklusa u kojem se nalazila interfazna jezgra u trenutku fuzije (8). Tako su kromosomi interfazne stanica u G1 fazi ciklusa građeni od jedne kromatide, u G2 fazi od dvije tijesno priljubljene kromatide, dok je kondenzacija kromatina interfazne jezgre u S fazi neujednačena i fragmentirana. PCC je opisan u otprilike 70-ero bolesnika sa solidnim tumorom, leukemijom i premalignim stanjima (9-13). Dosad provedena istraživanja obuhvatila su populaciju odraslih bolesnika, dok su ispitivanja u djece oskudna. Biološko i kliničko zna- čenje PCC-a u malignom procesu nije jasno. Smatra se da su produkti stanične fuzije i stanice s prematurno kondenziranim kromosomima sposobni za život i znače izvor genomske heterogenostI populacije tumorskih stanica (14,15). U ovom radu obavljeno je ispitivanje spontanog fuzijom potaknutog PCC-a u djece s akutnom leukemijom, a radi procjene učestalosti i biološke uloge poreme- ćaja.

MATERIJAL I METODE

Ispitano je 85-ero djece, 32 djevojčice i 53 dječaka, u dobi od 1 mjeseca do 15 godina. Kod 50-ero bolesnika postavljena je dijagnoza akutne limfocitne leukemije (ALL), kod troje su otkrivene morfološki nediferencirane stanice te je postavljena dijagnoza akutne nedifenecirane leukemije (ANL), ali su zbog fenotipskih svojstava uključeni u skupinu ALL. Dijagnoza akutne mijeloidne leukemije (AML) postavljena je kod 32-je djece. Citogenetič ko ispitivanje je provedeno u vrijeme postavljanja dijagnoze i prije početka terapije na preparatima dobivenim kratkotrajnom nestimuliranom kulturom stanica koštane srži ili periferne krvi. Nakon 24-satne kulture stanica slijedila je obrada s kolhicinom (0.1 μg/mL), hipotoničnom otopinom (0.075M KCl, 15 min., 37oC) i na kraju fiksacija stanica u mješavini metanola i octene kiseline u omjeru 3:1. Preparati su pripremljeni metodom su- šenja na zraku i bojani klasičnom metodom po Giemsi, GTG- i BCG- metodama pruga.
Ispitano je više od 15 stanica po bolesniku, te procijenjen modalni kariotip populacije stanica, prisutnost poliploidnih stanica i spontana pojava fuzijom potaknutog PCC-a.

REZULTATI

Prematurna kondenzacija kromosoma otkrivena je u 6-ero od 85-ero djece s akutnom leukemijom. Spontana pojava PCC-a utvrđena je u 3-je (9,4%) od 32-je djece s AML-om i u 3-je (5,7%) od 53-je djeteta s ALL--om (uključujući 3-je bolesnika s ANL-om) (tablica 1.). PCC je otkriven kod 1-og od 14-ero bolesnika s AML-M2, u 2-je od 10-ero djece s AML-M5 te u 3-je od 15-ero bolesnika s ALL-L1. Sve stanice s PCC-om imaju, uz metafazne kromosome, sitne kromosomske fragmente varijabilne veličine i intenziteta bojanja, što upućuje na fuziju mitotske i interfazne stanice u S-fazi staničnog ciklusa (Slika 1). Frekvencija stanica s PCC-om varira od bolesnika do bolesnika i nalazi se u rasponu od 5%-13,6%. Aberantan maligni klon identificiran je u 2-je od 6-ero djece s PCC-om. Kod bolesnika s AML-M2 analizirano je 38 mitoza koštane srži. PCC je otkrivena u 7,9% stanica, dok ostale imaju uredan broj i morfološ ki izgled kromosoma. Analizom stanica koštane srži pacijenta s AML-M5 identificiran je aberantan klon sa 46 kromosoma i translokacijom kromosoma 4 i 15. Klonski kromosomski poremećaj prisutan je u 12 od 22 ispitane stanice, dok je PCC otkriven u 13,6% stanica. Kod drugog bolesnika s AML-M5 ispitane su 23 stanice. Otkriveno je 8,7% stanica s PCC-om, dok 17 stanica pripada aberantnom klonu sa 46 kromosoma i translokacijom kromosoma br. 9 i 11. Kod troje bolesnika s ALL-L1 ispitano je 20, 108 i 40 stanica periferne krvi i otkriveno 5%, 5,6% i 5% stanica s PCC-om, dok su ostale urednog citogenetskog nalaza. Ovim ispitivanjem nisu identificirane polipoidne stanice u bolesnika a PCC-om.

RASPRAVA

Ovim ispitivanjem otkrivena je prematurna kondenzacija kromosoma u 6-ero (7,1%) od 85-ero ispitane djece s akutnom leukemijom. Istraživanja PCC-a u selekcioniranim skupinama bolesnika s tumorskom bolešć u su rijetka i obuhvaćaju odrasle bolesnike s leukemijom, solidnim tumorom i premalignim stanjem, dok izostaju sustavna ispitivanja u selekcioniranim skupinama djece. Učestalost PCC-a je varijabilna i kreće se od 0% do 56,25%. Tako su W i l l i a m s i s u r . otkrili PCC u 8 -ero (16,2%) od 37-ero pacijenata s AML-om, te K o v a c s i s u r . u 1-og (3,22%) od 31-og bolesnika s akutnom leukemijom (9,10). Dva provedena istraživanja upućuju na povezanost perzistentne poliklonalne B limfocitoze s binuklearnim limfocitima (PPBL) i PCC-om. PCC je otkriven u 18-ero (56,25%) od 32-je bolesnika s PPBL-om (11, 16). S druge strane PCC nije identificiran u 97-ero bolesnika s CML-om (9,10). Uz ispitivanje PCC-a u bolesnika s hemoblastozama, značajne su analize u onih sa solidni tumorom. R e i c h m a n i L e v i n otkrili su PCC u 2-je (7,1%) od 28-ero bolesnika s karcinomom debelog crijeva (12). K o - v a c s i s u r . su opisali pojavu PCC-a u troje (8,57%) od 35-ero bolesnika s karcinomima različitih histoloških tipova i podrijetla (10). Visoka frekvencija je utvr- đena u bolesnika s karcinomom grlića maternice. PCC je otkriven u 22-je (14,7%) od 150-ero bolesnika s tumorom (13). Frekvencija PCC-a je u većini provedenih ispitivanja, uključujući i naše istraživanje, u rasponu od 1-13%, dok je visok udio stanica s PCC-om opisan u bolesnika s akutnom eritroleukemijom (9). Razlikujemo dva mehanizma spontane pojave fenomena PCC. Tako značajnu ulogu u procesu fuzijom potaknutog PCC-a ima fuzija stanica i faktor za poticanje mitoze (MPF) (8,17). Fuzija stanica je posljedica poremećaja permeabiliteta stanične membrane, povezivanja stanica te spajanja staničnog sadržaja. Interfazna jezgra dolazi pod utjecaj MPF mitotske komponente stanične fuzije. MPF uzrokuje razgradnju jezgrine membrane uz kondenzaciju kromatina interfazne stanice u vidljiva tjelešca. Danas znamo da spontana pojava PCC-a može biti posljedica disfunkcije gena koji imaju značajnu ulogu u procesu spiralizacije kromosoma i kontrole stanične diobe. Značajan doprinos u razumijevanju ovih procesa dala su ispitivanja spontanog i kemijskim putem induciranog PCC-a (2, 18). Uloga spontane pojave PCC-a u malignom procesu nije jasna. Pojedini autori drže da je spontani PCC, kao posljedica poremećaja kontrolne točke u G2/M fazi ciklusa, svojstvo tumorskih stanica i izvor genetičke heterogenosti te rezistencije na terapiju (15). Istraživanja fuzijom potaknutog PCC-a upućuju na češću pojavu fenomena u tumorima s poliploidnim brojem kromosoma, varijabilnim brojem kromosoma ili sekundarnom modalnom vrijednošću u tetraploidnoj regiji (12-14). Stoga se smatra da je stanična fuzija/PCC jedan od mehanizama nastanka poliploidnih stanica, genetičke varijabilnosti populacije tumorskih stanica i evolucije tumorskog klona. Za razliku od solidnih tumora, rezultati provedenih ispitivanja ne upućuju na povezanost fuzijom potaknutog PCC-a i numeričkih poremećaja kromosoma u bolesnika s PPBL-om i leukemijom, uključujući i našu skupinu djece s AL-om. Stoga se može pretpostaviti da kod hemoblastoza novonastali poremećaj genoma ne pridonosi selektivnoj prednosti stanica.
Rezultati dosad provedenih ispitivanja u selekcioniranim skupinama osoba s tumorskom bolešću, uključujući i naše ispitivanje, upućuju na to da je stanična fuzija i spontana pojava PCC svojstvo pojedinih tipova bolesti i neovisna o dobi pacijenta. Ovim ispitivanjem nije dokazana povezanost fuzijom potaknutog PCC-a i poliploidije te rezultati upućuju na to da fenomen nije izvor genomske varijabilnosti tumorskih stanica u bolesnika s leukemijama. Nužna su, međutim, dodatna ispitivanja u selekcioniranim skupinama bolesnika, kako bi se procijenila povezanost PCC-a i drugih tipova i stadija tumorskih bolesti u djece.

LITERATURA
1. Maton G, Lorca T, Giraut JA, Ozon R, Jessus C. Differential regulation of Cdc2 and Aurora-A in Xenopus oocytes: a crucial role of phosphatase 2A. J Cell Sci 2005;118:2485-94.
2. Gotoh E , Durante M. Chromosome condensation outside of mitosis: mechanisms and new tools. J Cell Physiol 2006;209:297-304.
3. Neitzel H, Neumann LM, Schindler D, Wigres A, Tonnies H, Trimborn M, Krevsova A, Richter R, Sperling K. Premature chromosome condensation in humans associated with microcephaly and mental retardation: a novel autosomal recessive condition. Am J Hum Genet 2002; 70:1015-22.
4. Sandberg AA. Some comments regarding chromosome pulverization (premature chromosome condensation or PCC, prophasing). Virchows Arch. B Cell Path 1978;29:15-18.
5. Hittelman WN, Rao P. Mapping G1 phase by the structural morphology of the prematurely condensed chromosomes. J Cell Physiol 1978; 95:333-42.
6. Knuutila S, Siimes M, Vuopio P. Chromosome pulverization in blood diseases. Hereditas 1981;95: 15-24.
7. Bezrookove V, Smits R, Moeslein G, Fodde R, Tanke HJ, Raap AK, Darroudi F. Premature chromosome condensation revisited: a novel chemical approach permits efficient cytogenetic analysis of cancer. Genes Chromosomes Cancer 2003;38: 177-186.
8. Johnson RT, Rao PN. Mammalian cell fusion: induction of premature chromosome condensation in interphase nuclei. Nature 1970;226: 717-22. 9. Williams DM, Scott CD, Beck MT. Premature chromosome condensation in human leukemia. Blood 1976;47:687-93.
10. Kovacs G. Premature chromosome condensation: evidence for in vivo cell fusion in human malignant tumors. Int J Cancer 1985;36: 637-41.
11.Mossafa H, Troussard X, Valensi F, Schillinger F et al. Isochromosome i(3q) and premature chromosome condensation are recurrent findings in chronicB-cell lymphocytosis with binucleated lymphocytes. Leuk Lymphoma 1996;20:267-73.
12. Reichmann A, Levin B. Premature chromosome condensation in human large bowel cancer. Cancer Genet Cytogenet 1981;3:221-5.
13. Sreekantaiah C, Bhargava K, Shetty JN. Premature chromosome condensation in human cervical carcinoma. Cancer Genet Cytogenet 1987;24:263-9.
14. Atkin NB. Premature chromosome condensation in carcinoma of the bladder: presumptive evidence for fusion of normal and malignant cells. Cytogenet Cell Genet 1979;23.217-9.
15. Kovaleva OA, Glazko TT, Kochubey TP, Lukash LL, Kudryavets YI. Spontaneous premature condensation of chromosomes in normal and transformed mammal cells. Exp Oncol 2007;29:18-22.
16. Mossafa H, Malaure H, Maynadie M, Valensi F et al. Persistent polyclonal B lymphocytosis with binucleated lymphocytes: a study of 25 cases. Br J Haematol 1999;104:486-93.
17. Miake-Lye R, Kirschner MW. Induction of early mitotic events in a cell-free system. Cell 1985;41: 165-75.
18. Trimborn M, Bell SM, Felix C, Rishid Y, Jafri H, Griffiths PD, Neumann LM, Krebs A, Reis A, Sperling K, Neitzel H, Jackson AP. Mutation in microcephalin cause aberrant regulation of chromosome condensation. Am J Hum Genet 2004;75:

Opširnije