Genetske osnove razvojnog zaostajanja/mentalne retardacije

Premda je razvojno zaostajanje/mentalna retadracija čest poremećaj, uzroci u oko polovice slučajeva ostaju neprepoznati. U posljednje je vrijeme napredak molekularne citogenetike i molekularne genetike doveo do spoznaje da su submikroskopski poremeć aji genoma česti, dosad neprepoznati uzrok duševnog zaostajanja. Primjena novih tehnika omogućava prepoznavanje poznatih kliničkih entiteta i definiranje novih poremećaja. Prikazujemo današnja dostignuća na ovom području u kontekstu racionalne primjene dijagnostičkih postupaka u evaluaciji genetičkih uzroka razvojnog zaostajanja/mentalne retardacije. UVOD Razvojno zaostajanje (RZ)/mentalna retardacija (MR) definira se kao stanje zaustavljenog ili nepotpunog duševnog razvoja prisutno od djetinjstva, a obilježeno razinom intelektualnog funkcioniranja (IQ) _ 70 - 75 uz značajno ograničenje u bar dva područja adaptacijskih vještina nužnih za prilagodbu svakodnevnom životu (socijalne, funkcijske, akademske i dr.) (1, 2). Termin razvojno zaostajanje obično se rabi do dobi malog djeteta, jer se u tom razdoblju inteligencija ne može formalno testirati, pa se stoga sa sigurnošć u ne može postaviti dijagnoza MR. Duševno je zaostajanje zahvaća oko 2-3% populacije. Češće se javlja kod muškaraca (1.5:1) zbog mnogih X-vezanih bolesti praćenih mentalnom retardacijom. Premda je riječ o čestom poremeć aju, uzroci nastanka RZ/MR-a su u oko polovice slučajeva nepoznati. Bitno je postaviti točnu uzročnu dijagnozu, jer to omogućava predviđanje prognoze tijeka bolesti i mogućih komplikacija, primjenu specifičnih oblika liječenja i habilitacijskih programa te genetičko savjetovanje koje uključuje predviđanje rizika ponavljanja poremećaja u obitelji, mogućnost prevencije putem prenatalne dijagnoze i ispitivanje rizičnih članova obitelji (3). Od važnosti je i uključivanje u odgovarajuće skupine potpore koje će pomoći obiteljima da se što bolje prilagode novoj životnoj situaciji. Naime, kako je RZ/MR u pravilu doživotni poremećaj, značajno opterećuje obitelj u kojoj se javila, a i od šire društvene zajednice očekuje se da napravi sve kako bi pomogla zahvaćenima i njihovim najbližima da se što kvalitetnije uklope u svakodnevni život. Genetički poremećaji najčešći su uzrok RZ/MR-a koji se može dijagnostički potvrditi. Važnost genetičkih čimbenika u nastanku MR-a vidljiva je iz činjenice da su gotovo sve kromosomske aberacije praćene razvojnim zaostajanjem. Uz to, OMIM (McKusickov katalog mendelski nasljednih bolesti) citira više od 1300 monogenskih poremećaja praćenih MR-om (4). Baš zbog velikog broja raznolikih klinič kih entiteta etiologijsku dijagnozu nije lako postaviti. Prema izvješću konferencije Nacionalnog Instituta za zdravlje SAD-a iz 1995. uzrok razvojnog zaostajanja može se utvrditi u 40-60% zahvać enih. U posljednjih se desetak godina dijagnostika genetičkih bolesti značajno razvila, tako da je udio bolesti praćenih RZ/MR-om koji se može dijagnosticrati zacijelo veći. Uz genetičke čimbenike oštećenju intelektualnih funkcija mogu pridonijeti razni problemi u trudnoći (uporaba droge, alkohola te raznih lijekova, infektivne i metaboličke bolesti majke, slabija prehrana ploda i dr.), oštećenja u porođaju (hipoksija, krvarenje) i nakon porođaja (infekcije središnjeg živčanog sustava, trovanja olovom, živom, ugljičnim monoksidom i dr.). Kako se inteligencija nasljeđ uje multifaktorski (poligeno uz zna- čajan utjecaj čimbenika okoline), u kulturno i društveno depriviranim sredinama djeca često nemaju odgovarajući poticaj za razvoj, a u slučajevima kad je njihov ukupni genetički potencijal podprosječan do graničan, to može dovesti do tzv. obiteljske mentalne retardacije kod koje genetič ku predispoziciju zasad ne možemo definirati laboratorijskim pretragama (3). Imajući u vidu ovako široku paletu uzroka RZ/MR-a, liječnik se često nađe u nedoumici kako pristupiti osobi s RZ/MR-om – koje pretrage bi trebalo obaviti i koja je vjerojatnost da će one otkriti uzrok poremećaja. Prikazujemo današnja dostignuća na ovom području u kontekstu racionalne primjene dijagnostič kih postupaka u evaluaciji genetičkih uzroka RZ/MR-a. A n a m n e z a i k l i n i č k i p r e g l e d Osnovu dijagnostičkog postupnika RZ/MR-a i dalje čine detaljna obiteljska i osobna anamneza te klinički pregled. Obiteljska anamneza obuhvaća analizu obiteljskog stabla kroz tri generacije, a osobna sve detalje razvoja, uključujući prenatalno i perinatalno razdoblje uz obvezno registranje svih relevantnih podataka (gestacijska dob kod porođaja, procjena zrelosti, tjelesna masa i dužina, opseg glave, bodovanje APGAR-a itd.). Tijekom fizikalnog pregleda potrebno je posebno obratiti pozornost na tjelesni razvoj, prisutnost dismorfičnih crta i/ili pridruž enih anomalija. Uz neurologijski pregled, važna je i evaluacija fenotipa ponašanja. Fotografije bolesnika (često u različitoj dobi) kao i video zapisi pomoći će da se dokumentiraju osnovna klinička obilježja te će poslužiti kao važan podsjetnik prilikom pretrage literature u potrazi za sličnim bolesnicima. Nužno je pregledati i druge članove obitelji, kako bi se uočile osobe sa sličnim kliničkim obilježjima ili potvrdilo da osoba jasno odstupa od izgleda ostalih članova obitelji, što nerijetko upućuje na genetički, često sindromski poremećaj (3). Preporuč a se da pregled obavi klinički genetič ar koji može uočiti i objektivno evaluirati dismorfične znakove te ih uz ostale nalaze povezati u odgovarajući klinički fenotip (5, 6). V a n K a r n e b e e k i s u r . navode da pregled kliničkog genetič ara povećava vjerojatnost dijagnoze u čak 39-81% slučajeva (7). Već na temelju podataka dobivenih općim pregledom nerijetko se može postaviti dijagnoza ili usmjeriti pretrage u dobrom smjeru te dijagnozu potvrditi određenom citogenetič kom ili genskom analizom. Za postavljanje dijagnoze prijeko je potrebno praćenje, a obrada bi trebala biti postupna, temeljena na isključivanju naj- češćih stanja, odnosno prvenstveno onih na koje upućuje klinička slika, tako da bi bila što učinkovitija uz što manje troškove za zdravstveni sustav. Brzina obrade bolesnika ovisi i o njegovoj dobi, težini i složenosti kliničke slike kao i o reproduktivnim planovima obitelji. Ne treba izgubiti iz vida činjenicu da dio bolesnika prilikom pregleda izgleda neupadno, bez izraženih dismorfičnih crta, a da naposljetku ipak bude dijagnosticiran genetič ki poremećaj. Dok se nekad smatralo da je vjerojatnost postavljanja dijagnoze to veća što je veći stupanj zaostajanja, danas se zbog napretka dijagnostičkih metoda ta razlika gubi (8, 9, 10). 1. Subspecijalistički pregledi, laboratorijska i neuroradiološka dijagnostika Nakon fizikalnog pregleda slijede oni subspecijalistički – okulista (pregled vida i očne pozadine, prema potrebi pregled biomikroskopom, elektroretinografija i dr.), otorinolaringologa (ispitivanje sluha), neuropedijatra (EEG), psihologa, logopeda/ defektologa, psihijatra i prema potrebi drugih specijalnosti. Više ispitivanja pokazalo je važnost EEG zapisa i slikovnih prikaza SŽS-a u otkrivanju uzroka MR/RZ-a (5, 8, 9, 11). Strukturne abnormalnosti mozga nađu se post mortem analizom u čak 34-98% teško mentalno retardiranih osoba, dok su abnormalnosti u slikovnim prikazima nalaze u 9-60% oboljelih (5, 9). Premda su slikovni prikazi SŽS-a posebno indicirani u slučajevima kad bolesnik ima neurologijske simptome, mikrocefaliju, kraniosinostozu ili makrocefaliju, magnetna spektroskopija može otkriti metaboličke poremeć aje i u bolesnika bez žarišnih simptoma kao i u onih urednih biokemijskih nalaza u krvi i urinu (5, 10). Uzročno povezivanje otkrivenih morfoloških abnormalnosti u slikovnim prikazima središnjeg živčanog sustava s razvojnim zaostajanjem nije jednostavno, jer se još nedovoljno zna o prisutnosti morfoloških odstupanja u građi mozga u općoj populaciji. Ukoliko uz RZ/MZ nemamo drugih simptoma i znakova metaboličke bolesti, korist metaboličkih pretraga je mala (5, 10). Kako ipak ne bismo propustili neki od rijetkih metaboličkih poremećaja koji se prezentira atipičnom ili blagom kliničkom slikom, preporuča se napraviti osnovne metaboličke analize iz krvi i urina (3). U posljednje je vrijeme uočeno da mnoga djeca s blaže dismorfičnim crtama, hipotonijom, raznolikom neurologijskom simptomatologijom i RZ/MR-om imaju neki od poremećaja glikozilacije, pa se u takvim slučajevima predlaže napraviti osnovne testove poput izoelektričnog fokusiranja serumskih transferina (10). 2. Citogenetika i molekularna citogenetika 2.1. Klasična kariotipizacija U rutinskoj citogenetskoj obradi svjetlosnim se mikroskopom analiziraju metafaze i prometafaze kromosoma koji su obojeni tako da do izražaja dolazi obrazac svjetlijih i tamnijih pruga karakterističan za svaki kromosom. Analiziraju se stanice koje se dijele, obično leukociti periferne krvi i fibroblasti. Ova metoda ima moć razlučivanja od 5-10 milijuna parova baza (Mb), pa manji poremećaji genoma ostaju neotkriveni. Više studija je nastojalo utvrditi u kojem dijelu osoba s RZ/MR-om možemo otkriti kromosomski poremećaj primjenom metoda standardne kariotipizacije. Rezultati su različiti, u rasponu od 4-34% (5, 7,12). Tome su razlog veličina uzroka, različit odabir bolesnika, kao i razlike u primjeni citogenetičkih tehnika. Neprijeporno je, međutim, da su citogenetič ke aberacije najvažniji uzrok RZ/MR-a koji je dostupan dijagnozi (7). Najčešće je riječ o Downovom sindromu, koji ima oko 9% svih osoba s RZ/MR-om, a rjeđe o drugim numeričkim ili strukturnim kromosomskim poremećajima koje nalazimo u oko 3-4% slučaja (6, 7). Stoga je kod svake osobe s RZ/MR-om čak i u odsutnosti jasne dismorfije standardni postupak kariotipizacija na razini rezolucije od najmanje 550 pruga (5, 13, 14). Tehnike kariotipizacije s visokom moći razlučivanja od 3-5 Mb koje analiziraju kariotip na razini od 550-1000 pruga otkrivaju dodatno još 3-4% kromosomskih abnormalnosti. 2.2. Fluorescencijska in situ hibridizacija (FISH) Već uobičajenim klasičnim citogenetič kim metodama prije desetak godina se pridružila FISH analiza. Premda je kariotipizacija još i sad osnovna pretraga i zlatni standard u obradi djece i osoba s RZ/MR-om, danas se ona obvezno upotpunjava ovom metodom. FISH se služi specifičnim DNA sondama, označenim ugradnjom kemijski preoblikovanih nukleotida koje neposredno fluoresciraju ili mogu biti otkriveni vezanjem za molekulu obilježenu fluorescencijom. FISH sonde mogu hibridizirati kako s kromosomima u metafazi tako i s interfaznim jezgrama. Postoji više vrsta sonda – one kojima se obilježava cijeli kromosom, sonde za obilježavanje centromera, sonde specifič ne za lokuse pojedinih mikrodelecijskih sindroma te sonde za obilježavanje subtelomernih regija. Razvijene su tehnike predočavanja cijeloga kromosomskog seta u 24 različite boje (M-FISH i SKY), kao i višebojni test za centromere (M-cen) i subtelomerne kromosomske poremećaje (M-TEL). FISH sonde mogu otkriti regije reda veličine i do 0,5 kb, što je veliki napredak u usporedbi s tehnikama pruganja. Metoda je brza i osjeljiva, ne trebamo kulturu stanica. jer se mogu analizirati i interfazne jezgre, nalaz je lakše analizirati nego kariotip. Dakako, FISH metode imaju i svoje nedostatke, pa je prilikom odluke o tome koju pretragu primijeniti potrebno detaljno poznavanje dosega pojedine metode (15). FISH je već niz godina prva metoda u dijagnostici poznatih mikrodelecijskih sindroma (tablica 1). Mikrodelecijski sindromi najčešći su uzrok RZ/MZ-a nakon strukturnih kromosomskih poremećaja vidljivih standardnom kariotipizacijom, pa ih nalazimo u 1,3-4,7% osoba s MR/RZ-om, ovisno o tome tko je postavio indikaciju za ispitivanje, jer je za točnu dijagnozu potrebno kliničko iskustvo u prepoznavanju kliničke slike. Pretpostavlja se da je ukupan udio poznatih mikrodelcijskih sindroma u skupini bolesnika s RZ/MR-om 5,3% (5, 6). Na osnovi spoznaje da su subtelomerne regije kromosoma posebno bogate genima te da su skriveni strukturni poremeć aji u tim regijama nerijetko odgovorni za razvojne poremećaje, razvilo se više metoda analize subtelomernih regija kromosoma, uključujući FISH sa subtelomernim sondama (12, 17, 18). Dosad je objavljen niz ispitivanja subtelomernih regija tehnikom FISH-a u koja je uključeno više tisuća bolesnika. Skrivene abnormalnosti kromosoma nađene su u oko 5-6% osoba s RZ/MR-om (12, 17, 18, 19, 20, 21). Procjenjuje se da pravih kriptičkih translokacija ima oko 2,6%, jer je prosječna veličina aberacija oko 10 Mb, pa bi se pri detaljnijoj ili ponovnoj analizi oko polovice ovih aberacija ipak moglo vidjeti klasičnom metodom kariotipizacije koja rabi razinu pruganja od 550 i više pruga (6, 21,22). Kod subtelomernog FISH-a treba uvijek isključiti postojanje polimorfizama, posebno 2qter koji je prisutan u 1,6-6% slučajeva (19). Opaženi su također polimorfizmi za 7pter, 15q12, 1q21, 9p11 i 16p11. U tim regijama nalazimo varijacije i u inače zdravih pojedinaca. Još se nedovoljno zna o submikroskopskim varijacijama normalnih kromosoma, pa je sve nalaze potrebno tumačiti s oprezom, uz obveznu analizu roditelja, a po mogućnosti uz potvrdu s jednom od komplementarnih metoda. 2.3. Multiple ligation probe amplification (MLPA) U posljednje se vrijeme za probir subtelomernih regija posebno pokazala pratkič nom i jednostavnom metoda višestrukog umnažanja vezanih sondi (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA). K o o l e n i s u r . 2004. su ovom metodom utvrdili učestalost kriptič kih subtelomernih aberacija od 4,3% (23). Metoda omogućava određivanje 40 različitih sekvencija nukleinskih kiselina u jednoj ili dvije PCR reakcije, a komercijalno su dostupna dva kita. Zbog svoje brzine i relativne jednostavnosti MLPA brzo zamjenjuje subtelomerni FISH (24,25). Najnovije smjernice citogenetičke obrade bolesnika s MR/RZ-om nalažu da je nužno napraviti kariotipizaciju primjenom tehnika visoke moći razlučivanja ( > 550 pruga), ciljanu FISH analizu te subtelomerni probir (13). Kako u kliničku praksu ulaze nove metode komparativne genomske hibridizacije na matrici (array CGH), za očekivati je da i one vrlo skoro budu uključ ene u dijagnostički postupnik. 2.4. Komparativna genomska hibridizacija (CGH) Premda je probir subtelomera visoko osjetljiva metoda, njen je nedostatak u tome što je usmjerena samo na krajeve kromosoma, a ne na cjelokupni genom, te ne otkriva kriptičke aberacije u interstici- ju. Tehnike probira cijelog genoma nadoknađ uju taj nedostatak. Danas je u uporabi veći broj metoda probira cijelog genoma, a cilj je postići što bolje razlučivanje uz što manje tehničkih poteškoća. Komparativna genomska hibridizacija koristi hibridizaciju na metafazne kromosome na pokrovnom stakalcu kako bi se pregledao cijeli genom u jednom postupku s rezolucijom >5-10 Mb (26). Rabi se kao skrining cijelog genoma, premda njena moć razlučivanja nije bitno bolja od kariotipizacije visoke rezolucije. 2.4.1. Komparativna genomska hibridizacija visokog razlučivanja (High Resolution Comparative Genome Hybridization, HR-CGH) Komparativna genomska hibridizacija visokog razlučivanja služi se dinamičnim standardnim referentnim intervalima umjesto fiksnog praga, što trostruko pove- ćava osjetljivost u usporedbi sa standardnom pa je moć razlučivanja povećana na _ 3Mb (27). Rutinsko ispitivanje neselekcioniranih osoba s RZ/MR-om urednog kariotipa otkrit će ovom metodom oko 12% abnormalnosti kromosoma, pretež no delecija, smještenih u intersticiju (28). HR-CGH je dobra metoda za rutinsku analizu osoba s RZ/MR-om, no nedostatak joj je što ne otkriva balansirane translokacije, kao ni dio mikrodelecijskih sindroma kod kojih su delecije ispod razine rezolucije ove tehnike. Stoga je za poznate mikrodelecijske sindrome karakteristič nog kliničkogi fenotipa najbolje i dalje rabiti specifične FISH sonde. Kad je klinički fenotip nespecifičan i neupadan, bolje je rabiti HR-CGH kao probir kojim će se katkad otkriti nečekivana mikrodelecija. Premda je metoda manje osjetljiva nego probir subtelomera kod kojeg je rezolucija jednaka veličini sondi (30 - 100 kb), ima veći postotak pozitivnih nalaza jer otkriva i intersticijske poremećaje. 2.4.2. Molekularna kariotipizacija Najnovije metode analize submikroskopskih poremećaja zamijenile su metafazne kromosome komadićima DNA na silikonskim ili staklenim matricama (array CGH). Ove metode primjenjuju BAC-ove (bakterijske umjetne kromosome), polimorfizme jednog nukletoida (SNP; single nucletode polymorphism) odnosno sintetizirane oligonukleotide imobilizirane na stakalcima. Omogućavaju ispitivanje cijelog ljudskog genoma na razini razlučivanja koja je _50-1000 puta veća nego rutinska kromosomska analiza (29, 30). Osjetljvost svih inačica ove metode je vrlo velika. Rezolucija ovisi o veličini i razmaku između klonova koje nalazimo na matrici. Klonovi mogu biti razmješteni ciljano, na mjestima gdje se nalaze poznati mikrodelecijski/duplikacijski sindromi (tzv. targeted array) ili su raspršeni po cijelom genomu (tzv. tiling path). Metodu primjenjujemo u ispitivanju naoko balansiranih kromosomskih aberacija s kliničkim manifestacijama te u ispitivanju osoba normalnog kariotipa kod kojih nalazimo mentalnu retardaciju, dismorfične crte, i/ili kongenitalne malformacije. Ona otkriva 14-20% aberacija. Oko 9-10% su intersticijske, a ostale subtelomerne. Bar polovica ih se ne može otkriti na razini pruganja od 550 i više pruga (31, 32, 33, 34, 35). Zbog svoje visoke cijene array CGH se donedavno rabio samo u pojedinim specijaliziranim laboratorijima. Prednosti ove metode su velike. Otkriva nebalansirane poremećaje u cijelom genomu, uključujući i mozaicizam, jednostavnija je i brža u odnosu na FISH i MLPA, količina uzorka je mala. Kako je pogodna za automatizaciju, predviđa se da će njena cijena biti sve dostupnija (36). Relativni nedostatak ove metode je u tome da ne otkriva balansirane poremeć aje, a otkiva veći broj polimorfnih varijacija, što predstavlja problem prilikom tumačenja nalaza. Nerijetko za neke aberacije nije jasno jesu li uopće povezive s kliničkom slikom bolesnika, jer danas još nedovoljno poznajemo fenotipski učinak viška/nedostatka genetičkog materijala u pojedinim regijama kromosoma. Kako bismo utvrdili je li uočeni poremećaj na kromosomu poveziv s kliničkom slikom, nužno je najprije potvrditi aberaciju nekom o drugih raspoloživih tehnika, a potom ispitati roditelje da se vidi je li poremeć aj naslijeđen ili je nastao de novo. Roditelji mogu biti zdravi, ali i zahvaćeni blaže od djece. Razlika u kliničkoj slici između roditelja i djeteta može se objasniti varijabilnošću ekspresije fenotipa, a u nekim slučajevima i genomskim biljegovanjem ili razlikom u veličini delecije između zahvaćenog roditelja i djeteta. Kako bi se metoda do kraja razvila i omogućila njena rutinska primjena u klinič koj praksi, nužno je stvaranje kataloga polimofrnih klonova i potvrđivanje promjena u njihovim slijedovima (37). Naime, array CGH je dovela do otkrića opsežnih genomskih preraspodjela od nekoliko kilobaza do megabaza. Te se promjene nazivaju varijacije u broju kopija (CNV, copy number variations). Pretpostavlja se da su CNV uzrokom različitosti među ljudima i da su odgovorni za evolucijske procese, no isto tako je moguće da mogu utjecati i na klinički fenotip, pa dovesti i do različitosti u spoznanom razvoju, ponašanju i psihologijskim profilima (36). Istraživanja njihove uloge tek su u začetku. Za očekivati je da će array CGH s vremenom postati dostupniji te da će zamijeniti FISH i MLPA, jer omogućava pregled cijelog genoma u jednoj hibridizaciji i s velikom moći razlučivanja. Metoda se stalno usavršava. Tako tiling-resolution BAC matrice imaju desetorosturku veću pokrivenost genoma nego rutinski koriš tene BAC matrice koje imaju rezoluciju od 1 Mb (38). Ovaj sustav je precizniji, ima značajno manje lažno pozitivinih rezultata i omogućava bolje mapiranje aberacija, te posljedično i bolje povezivanje s genima koji se nalaze u zahvaćenoj regiji. Druge obećavajuće tehnike primjenjuju oligonukleotide, genom se prekriva gustom mrežom SNP-ova ili sondi posebno usmjerenih na subtelomerne regije (39, 40, 41, 42). Premda se submikroskopski kromosomski poremećaji mogu naći i u djece s razvojnim zaostajanjem bez drugih simptoma, još uvijek se preporuča selekcija bolesnika, jer su subtelomerni probir putem FISH-a ili HR-CGH tehnike skupe te tehnički zahtjevne i dugotrajne metode. Najviše se služimo odabirom bolesnika prema d e V r i e s u i s u r . (2001.) koji uključuje: 1) pozitivnu obiteljsku anamnezu 2) prenatalni zastoj u rastu 3) postnatalni zastoj u rastu ili pojačan rast 4) dvije ili više dismofičnih crta lica 5) jedno ili više dismorfičnih obilježja i/ili kongenitalnih malformacija (43). Strategija obrade bolesnika prvenstveno ovisi o mogućnostima laboratorija. Ako su nam dosutpne sve tehnike u slu- čajevima RZ/MR-a kad ispitivana osoba nije dismorfična niti ima pridruženih malformacija, najbolje je pretrage odmah po- četi metodom array CGH, jer je vjerojatnije da će se otkriti kromosomski poremeć aj nego rutinskom kariotipizacijom (44). Ako tehnikom subtelomernog probira, HR-CGH ili array CGH, otkrijemo poremećaj, potrebno je potvrditi rezultat jednom od komplementarnih tehnika te ispitati roditelje. Metode molekularne ge- netike primjenjuju se kako bi se točnije definirala mjesta loma te ispitali geni u zahvaćenoj regiji, koji bi mogli utjecati na fenotip (45). Pritom je važno pretragom literature te kontaktiranjem baza podataka i suradnih citogenetičkih laboratorija pronaći bolesnike koji imaju poremećaj u istoj regiji, te usporedbom njihovog genotipa i fenotipa ocrtati kliničku sliku poremeć aja (46, 47). Ovim metodama otkrivaju se novi mikrodelecijski sindromi, od kojih smo već neke uključili u dijagnostič ke panele (tablica 2). U zaključku se može reći da se kromosomski poremećaji otkrivaju u oko 29% osoba s RZ/MR-om. Od toga je oko polovice vidljivo standardnim citogenetičkim metodama ako se primjenjuju metode pruganja visoke rezolucije, dok je druga polovica vidljiva na molekularnoj razini. Molekularna kariotipizacija putem array CGH ne otkriva samo mali broj naoko banalsniranih de novo aberacija. Prva ispitivanja isplativosti dijagnostičkog pristupa u kojem se počinje s nekom od array CGH metoda, pokazala su da bi one mogle biti uključene u dijagnostički postupnik uz minimalni porast troškova (48). Stoga je danas array CGH metoda izbora u dijagnostici RZ/MR-a. 2.5. Molekularna genetika 2.5.1. Dijagnostika monogenskih sindroma Oko 5% osoba s RZ/MR-om imaju neki od poznatih monogenskih sindroma poput sindroma Cornelia de Lange, Coffin Lowry, Coffin-Siris, Kabuki make-up i dr. koji se često mogu potvrditi molekularnim analizama. Posebno je važno obratiti pozornost na gene smještene na X kromosomu koji uzrokuju RZ/MR i koji su odgovorni za veću prisutnost ovog poremeć aja kod muškog spola. X-vezanu mentalnu retardaciju (XLMR) klinički dijelimo na sindromsku i nesindromsku. U sindromskim slučajevima dijagnozu je lakše postaviti, jer postoje i drugi simptomi/ znakovi koji olakšavaju dijagnostički proces. Danas je poznato dvadesetak gena koji mogu uzrokovati nesindromsku XLMR, no to su pojedinačno vrlo rijetki klinički entiteti, s izuzetkom mutacija u genu ARX koju se može naći u oko 10% obitelji s XLMR-om. Mutacije u genu ARX česte su u slučajevima kad obiteljska anamneza upućuje na X-vezani poremeć aj, ali su rijetke u sporadičnim slučajevima razvojnog zaostajanja (49). Procjenjuje se da oko 11,8% dječaka s RZ/MR-om ima X-vezani poremećaj, uključ ujući 3% muške djece sa sindromom fragilnog X-a te oko 1% dječaka sa de novo X-vezanim mutacijama (50). Ovi su poremećaji važni i u evaluaciji RZ/MR-a kod žena koje mogu imati de novo mutacije te simptome zbog nepravilne inaktivacije kromosoma X. Metode MLPA i array CGH danas pomažu u otkrivanju novih poremećaja genoma vezanih za XLMR (50, 51, 52). 2.5.2. Uniparenta disomija Uniparentna disomija (UDP) nastaje kad se oba homologna kromosoma naslijede od jednog roditelja. Rezultat je bar dvije porgrješke u razdvajanju kromosoma tijekom mitoze ili mejoze. Kako je riječ o nerazdvajanju, češća je kod starijih žena. UDP dovodi do patološkog fenotipa zbog poremećaja ekspresije tzv. biljegovanih gena na određenim regijama kromosoma. Većina gena prepisuje obje genske kopije – alela, no kod biljegovanih gena prepisuje se samo jedna (monoalelna ekspresija), ovisno o tome je li podrijetlom od oca ili majke. U slučaju UDP-a ili drugih poremećaja genskog upisa biljegovani geni ne stvaraju genski produkt ili se u rjeđim slučajevima produkt stvara pojačano. Premda je UDP opisana kod svih kromosoma, klinički je značajna samo kod kromosoma 6, 7, 22, 11, 14, 15 i 16. UPD nalazimo kao uzrok razvojnog zaostajanja u malog broja bolesnika (>1%). Može uzrokovati Angelmanov, Prader Willijev, Russell Silverov i Beckwith Wiedemanov sindrom. UDP 14 mat ima blaže razvojno zaostajanje, hipotoniju, fenotip nalik na sindrom Prader Willi. Klinička slika je varijabilna od naizgled normalne do mnogih pridruženih simptoma uključujući zastoj rasta, prijevremeni pubertet i dismorfične crte. UDP 14 pat također ima varijabilan fenotip, a može biti povezan s mentalnom retardacijom, dismorfijom i raznim pridruženim malformacijama. 2.5.3. Sindrom fragilnog X kromsoma Najčešći molekularni mehanizam sindroma fragilnog X-a je tzv. dinamička mutacija. Riječ je o proširenju regije CGG tripleta u egzonu 1 gena FMR1. U općoj populaciji učestalost nositeljica premutacije (50-200 CGG tripleta) je 1:250 -300 (53, 54). Ekspanzija_200 tripleta dovodi do metilacije i inaktivacije gena FMR1. Uz punu mutaciju i potpunu metilaciju mogući su i tzv. mozaici dužine tripleta (u dijelu stanica puna mutacija, u drugom dijelu premutacija ili normalni aleli), te metilacijski mozaici (puna mutacija, ali nepotpuna metilacija, što ipak dovodi do stvaranja manje količine FMR1 proteina) i njihove kombinacije. Molekularna dijagnostika sindroma fragilnog kromosoma X saživjela je u rutinskoj kliničkoj praksi (55). Osim dinamič kih mutacija, u genu FMR1 može doći i do delecija i točkastih mutacija. Protein FMR1 ima važnu ulogu u regulaciji sinteze bjelančevina u središnjem živčanom sustavu. Posebno se intenzivno sintetizira u vrhovima dendritičnih nastavaka kao odgovor na sinaptičku aktivnost. Gen FMR1 vjerojatno utječe i na ekspresiju drugih gena, što u konačnici formira klinički fenotip (56). Tipična klinička slika sindroma fragilnog X-a uključuje duševno zaostajanje uz karaktristične dismorfične crte - relativnu makrokraniju, izduženo lice, velike uške i izbočenu bradu. Mogu biti prisutna i mnoga druga displastična obilježja, a pridruž eni karakteristični nalazi su hipotonija i pojačan laksitet te makroorhija u starije djece. Kako klinička prezentacija nije uvijek upadljiva, posebno u mlađoj dobi bolesnika i kod ženske djece, molekularna analiza gena FMR1 je indicirana u svim slučajevima RZ/MR-a. Klinička preselekcija bolesnika značajno povećava udio pozitivnih nalaza (57). Razni oblici skrininga rizičnih populacija, uključujući i trudničke, već su više godina prisutni u pojedinim sredinama (53, 54, 55). Poseban klinički entitet čini sindrom fragilnog X-vezanog tremora/ataksije (FXTAS). To je neurodegenerativan poremć aj koji se očituje akcijskim tremorom i ataktičnim hodom, a može imati i simptome parkinsonzima, demencije, disautonomije i neuropatije. FXTAS je uzrokovan premutacijom u genu FMR1 (55-200 CGG tripleta) i vjerojatno je jedna od najčešćih monogenskih neurodegenerativnih bolesti u muškaraca (59, 60). 2.5.4. Rettov sindrom i MECP2 mutacije Rettov sindrom je X-vezani razvojni poremećaj za koji se smatra da je drugi po učestalosti uzrok RZ/MZ-a kod ženske djece. U klasičnom Rettovom sindromu u oko 80% slučajeva nalazimo mutacije u genu methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) (61, 62, 63). Klasični Rettov sindrom obilježen je progresivnim neurologijskim poremećajem, koji u djevojčica tijekom prvih 6-18 mj. dovodi do regresije u području motorike i razvoja govora. Najupečatljivija obilježja sindroma su smanjenje rasta opsega glave, gubitak ciljnih te razvoj stereotipnih pokreta ruku, najčešće u vidu „pranja“. Bolest je uključ ena u autistični spektar poremećaja zbog karakterističnih komunikacijskih teškoća. Bolesnice u mlađoj dobi imaju nerijetko napadaje neutješnog plača, a poslije panike, često su prisutni apneja/hiperpneja i bruksizam. Od neurologijskih simptoma prisutni su epilepsija, ataksija, apraksija i tremor. Bolest se s vremenom stabilizira, no teško oštećenje u pravilu ostaje. Uz klasičnu sliku mutacije gena MECP2 mogu se naći i u djevojčica s atipič nim Rettovim sindromom. Simptomi su autizam, smetnje učenja, RZ/MR sa spasticitetom ili tremorom nalik na Angelmanov sindromu (64). Testiranje je stoga indicirano u bolesnika s kliničkom slikom Angelmanovog sindroma kod kojeg je isključena mikrodelecija, UDP ili mutacija u genu UBE3A te duplikacija 15q11-q13. Ako je rezultat negativan, u daljnjoj obradi može se napraviti analiza enzima MTHFR (metilen tetrahdrofolat reduktaze) te analiza mutacije u genu ARX (10). Mutacije u genu MECP2 mogu se utvrditi i kod 1,3 – 1,7% dječaka s RZ/MR-om. Težina kliničke slike varira od blagog zaostjanja do teške novorođenač ke encefalopatije, koja nerijetko zavr- šava letalno u dojenačkoj dobi ili dobi malog djeteta (65, 66). MECP2 mutacije mogu se otkriti i u obiteljima s XLMR-om, u kojima simptomi mogu varirati od blagog neprogesivnog zaostajanja u ženske djece do težih oblika u muškaraca praćenih manično-depresivnom psihozom, piramidnim znacima, makroorhidizom i parkinsonovom bolešću (sindrom PPM-X ) (67). Ispitivanje gena MECP2 indicirano je samo u klinički preselekcioniranih bolesnika s RZ/MR-om (68, 69). Obrada bolesnika s pervazivnim razvojnim poremećajem Posebnu skupinu bolesnika čine djeca/ osobe s pervazivnim razvojnim poremeć ajima (Pervasive Developmental Disorders, PDD). Procjenjuje se da je učestalost PDD-a 6:1000 školske djece. Prema američkom Dijagnostičkom i statistič kom priručniku za duševne poreme- ćaje (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM-IV) i Internacionalnoj klasifikaciji duševnih poremeć aja i poremećaja ponašanja (International Classification of Diseases, ICD10) pod PPD ili autističnim spektrom poremeć aja (ASD, Autistic Spectrum Disorders) obuhvaćeni su 1) autizam ili autistič ki poremećaj (OMIM 209850), 2) Aspergerov sindrom, 3) Rettov sindrom (OMIM 312750), 4) dezintegracijski poremeć aj dječje dobi i 5) pervazivni razvojni poremećaji, nespecifični/nesvrstani (2, 70). Oko trećine čini autizam koji je obilježen ritualističkim repetitivnim ponaš anjem, oštećenjem socijalne interakcije, komunikacije i razvoja govora (71). Oko 70% djece s autizmom ima RZ/MR. Četvrtina djece koja u dobi od 2-3 godine ispunjava kriterije za dijagnozu autizma s vremenom će početi komunicirati te će se u dobi školskog djeteta uklopiti u školovanje i druženje sa zdravom djecom. Ostala djeca, a kasnije i odrasli, imat će doživotno u većoj ili manjoj mjeri adaptacijske poteškoće, koje će zahtijevati intenzivan rad u obitelji, uz odgovarajuće habilitacijske i edukacijske programe. Ova skupina bolesti je većim dijelom idiopatska, tj. uzrok je nedovoljno poznat, no pouzdano se može reći da je multifaktorski, tj. da je više gena uključeno u nastanak ovih poremećaja, odnosno da postoji mogućnost da su različiti geni uključ eni u različitm obiteljima. Postoji velika heterogenost (kako alelna tako i lokusna), a uz genetičku predispoziciju vjerojatan je utjecaj epigenetičkih čimbenika i još nedovoljno poznatih čimbenika okoline. Nekoliko velikih studija kojima se pretraživao genom radi otkrivanja lokusa/ gena povezanih s nastankom autizma uputilo je na to da bi se oni mogli nalaziti u regijama kromosoma 2q, 3q, 7q, 6q, 11p12-p13, 13q, 15q, 17q te na kromosomima X i Y (72, 73). Rutinsko ispitivanje ovih regija zasad nije uključeno u klinič ku praksu, jer još nisu jasno identificirani geni smješteni u ovim regijama kromosoma koji bi bili odgovorni za sklonost pojedinca razvoju ASD-a. U oko 10-15% osoba s autizmom riječ je o specifičnim kliničkim entitetima koji u sklopu svoje kliničke slike imaju simptome ASD-a. Oko 10-15% osoba s ASD-om imaju kromosomsku aberaciju vidljivu uporabom klasične kariotipizacije. Najčešće je riječ o dup15q11-q13, 22q11.2, del(18)q, del 2q32 te nerazdvajanju spolnih kromosoma (74, 75). U dijelu osoba s ASD-om može se otkriti skriveni aneuploidni mozaicizam (76). Ispitivanja pokazuju da je oko 30% kromosomskih aberacija u osoba s ASD-om vidljivo tek uporabom tehnika velike moći razlučivanja kromosoma i/ili uporabom ciljanih tehnika FISH-a (77). Subtelomerni probir nije indiciran u obradi neselekcioniranih bolesnika s ASD-om, jer će rijetko dati pozitivan rezultat (78). Osobama s ASD-om koje imaju dismorfične crte ili pridružene malformacije, a uredan kariotip, preporuča se napraviti i probir subtelomera. Oko 1% osoba s ASD-om ima duplikaciju 15q11-q13 na kromosomu podrijetlom od majke. Najčešće je riječ o prekobrojnom izodicentriku 15q koji se lako otkriva klasičnom kariotipizacijom, a rjeđe je riječ o intersticijskoj duplikaciji u regiji gena SNRPN koja se dijagnosticira metodom FISH-a. Prekobrojni izodicentrik 15q najčešće nastaje de novo, dok intersticijska duplikacija u regiji 15q11-q13 može nastati i kao posjedica nebalansirane translokacije naslijeđene od roditelja. Delecija ove regije na majčinom kromosomu dovodi do Angelmanovog sindroma koji može biti uzrokovan i UPD15 pat, te mutacijama u genu UBE3A ili mutacijama koje mogu dovesti do pogrješ nog genomskog upisa u ovoj regiji. Smatra se da je Angelmanov sindrom uzrokovan nedostatkom ekspresije gena UBE3A podrijetlom od majke u središ njem živčanom sustavu ploda. Na isti način, pojačana ekspesija gena u 15q11-13 mogla bi uzrokovati pojačan rizik nastanku ASD-a. Simptomi vezani za dup15q11-13 raznoliki su i uključuju mentalnu retardaciju, smetnje koordinacije, konvulzije, te simptome sindroma ADHD. Uz UBE3A i drugi geni u ovoj regiji poput gena GABRB3 mogli bi biti važni u nastanku ASD-a. Oko 20-30% djece s autizmom ima makrocefaliju. Čini se da se kod ove djece češće nađu mutacije u genu PTEN (80,81), a u sklopu subtelomernog skrininga češće se nađe del 2q37.3. Ostale aberacije su najčešće sporadične ili dosad opisane kao rekurentne u malom broju slučajeva. Temeljita citogenetička obrada djece s ASD-om trebala bi uključivati kariotipizaciju tehnikama visoke rezolucije, s posebnim osvrtom na regije 15q11.2q13, 2q37 i Xp23.3 te FISH analizu regija 15q11.2q13 i 22q11.2 (75). Premda tek manji broj djece s autizmom ima sindrom fragilnog X-a (2,2-12%), bar polovica bolesnika s fragilnim X sindromom ima simptome pervazivnog razvojnog poremećaja, pa je indicirana analiza gena FMR1. Ako nema dodatnih specifičnih nalaza koji bi upućivali na poremećaj metabolizma, metabolički skrining djece s ASD-om najvjerojatnije će biti negativan (81). LITERATURA 1. American Association on Mental Retardation. Mental retardation: Definition, classification, and systems of supports. Washington, D.C.: American Association on Mental Retardation, 1992 2. World Health Organization: International Classification of mental and behavioural disorders. Clinical descriptions and diagnostic guidelines, 10th edn. Geneva: World Health Organization, 1993. 3. Barišić I, Petković I, Hećimović S. Evaluacija genetičkih uzroka mentalne retardacije. Liječ Vjesn 2003;125:71-7. 4. http://www.ncbi.nlm.nih.-gov/omim 5. Curry CJ, Stevenson RE, Aughton D, Byrne J, Carey JC, Cassidy S, Cunniff C,Graham J, Opitz J. JM Jr, Jones MC, Kaback MM, Moeschler J, Schaefer GB, Schwartz S, Tarleton. Evaluation of mental retardation: recommendations of a Consensus Conference: American Colege of Medical Gentics. Am J Med Genet 1997;72:468-77. 6. Rauch A, Hoyer J, Guth S, Zweier C, Kraus C, Becker C, Zenker M, Hüffmeier U,Thiel C, Rüschendorf F, Nürnberg P, Reis A, Trautmann U. Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation. Am J Med Genet A 2006; 140:2063-74. 7. van Karnebeek CD, Jansweijer MC, Leenders AG, Offringa M, Hennekam RC. Diagnostic investigations in individuals with mental retardation: a systematic literature review of their usefulness. Eur J Hum Genet 2005;13:6-25. 8. Battaglia A, Bianchini E, Carey JC. Diagnostic yield of the comprehensive assessment of developmental delay/mental retardation in an institute of child neuropsychiatry. Am J Med Genet 1999; 82:60-6 9. Hunter AG. Outcome of the routine assessment of patients with mental retardation in a gentics clinic. Am J Med Genet 2000;90:60-8. 10. Battaglia A, Carey JC. Diagnostic evaluation of developmental delay/mental retardation: An overview. Am J Med Genet C Semin Med Genet 2003; 117:3-14. 11. Battaglia A. Neuroimaging studies in the evaluation of developmental delay/mental retardation. Am J Med Genet C Semin Med Genet 2003;117:25-30. 12. Xu J, Chen Z. Advances in molecular cytogenetics for the evaluation of mental retardation Am J Med Genet Part C 2003;117C:15-24. 13. Schaffer LG. American College of Medical Genetics guideline on the cytogenetic evaluation of the individual with developmental delay or mental retardation. Genet Med 2005;650-4. 14. Moeschler JB, Shevell M. The Committee on Genetics. Clinical genetic evaluation of the child with mental retardation or developmental delays. Pediatrics 2006;2304-2316. 15. Barišić I. Citogenetska dijagnostika. Gynecol Perinatol 2003;12: Suppl(1):28-33. 16. Petković I, Barišić I. Evaluation of subtelomeric chromosome regions using multicolour FISH assay. Paediatr Croat 2003;47:1-4. 17. Knight SJ, Regan R, Nicod A, Horsley SW, Kearney L, Homfray T, Winter RM, Bolton P, Flint J. Subtle chromosomal rearrangements in children with unexplained mental retardation. Lancet 1999; 354(9191):1676-81. 18. Colleaux L, Rio M, Heuertz S, Moindrault S, Turleau C, Ozilou C, Gosset P, Raoult O, Lyonnet S, Cormier-Daire V, Amiel J, Le Merrer M, Picq M, de Blois MC, Prieur M, Romana S, Cornelis F, Vekemans M, Munnich A. A novel automated strategy for screening cryptic telomeric rearrangements in children with idiopathic mental retardation. Eur J Hum Genet 2001;9:319-27. 19. van Karnebeek CD, Koevoets C, Sluijter S, Bijlsma EK, Smeets DF, Redeker EJ, Hennekam RC, Hoovers JM. Prospective screening for subtelomeric rearrangements in children with mental retardation of unknown aetiology: the Amsterdam experience. J Med Genet 2002;39:546-53. 20. Petković I, Barišić I. Probir subtelomernih regija metodom fluorescentne in situ hibridizacije (FISH) u 31-og bolesnika sa smetnjama u razvoju. Paediatr Croat 2004;48:187-9. 21. Yu S, Baker E, Hinton L, Eyre HJ, Waters W, Higgins S, Sutherland GR, Haan E Frequency of truly cryptic subtelomere abnormalities--a study of 534 patients and literature review. Clin Genet 2005; 68:436-41. 22. Jalal SM, Harwood AR, Sekhon GS, Pham Lorentz C, Ketterling RP, Babovic-Vuksanovic D, Meyer RG, Ensenauer R, Anderson MH, Michels VV. Utility of subtelomeric fluorescent DNA probes for detection of chromosome anomalies in 425 patients. Genet Med 2003;5:28-34. 23. Koolen DA, Nillesen WM, Versteeg MH, Merkx GF, Knoers NV, Kets M, Vermeer S, van Ravenswaaij CM, de Kovel CG, Brunner HG, Smeets D, de Vries BB, Sistermans EA. Screening for subtelomeric rearrangements in 210 patients with unexplained mental retardation using multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA). J Med Genet 2004;41:892-9. 24. Rooms L, Reyniers E, Wuyts W, Storm K, van Luijk R, Scheers S, Wauters J, van den Ende J, Biervliet M, Eyskens F, van Goethem G, Laridon A, Ceulemans B, Courtens W, Kooy RF. Multiplex ligation- dependent probe amplification to detect subtelomeric rearrangements in routine diagnostics. Clin Genet 2006;69:58-64. 25. Palomares M, Delicado A, Lapunzina P, Arjona D, Amiñoso C, Arcas J, Martinez Bermejo A, Fernández L, López Pajares I. MLPA vs multiprobe FISH: comparison of two methods for the screening of subtelomeric rearrangements in 50 patients with idiopathic mental retardation. Clin Genet 2006;69: 228-33. 26. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992; 258(5083):818-21 27. Kirchhoff M, Gerdes T, Maahr J, Rose H, Bentz M, Dohner H, Lundsteen C. Deletions below 10 megabasepairs are detected in comparative genomic hybridization by standard reference intervals. Genes Chromosomes Cancer 1999;25:410-3. 28. Kirchhoff M, Pedersen S, Kjeldsen E, Rose H, Dunø M, Kølvraa S, Lundsteen C. Prospective study comparing HR-CGH and subtelomeric FISH for investigation of individuals with mental retardation and dysmorphic features and an update of a study using only HR-CGH. Am J Med Genet A 2004; 127:111-7. 29. Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo WL, Chen C, Zhai Y, Dairkee SH, Ljung BM, Gray JW, Albertson DG. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nat Genet 1998;20:207-11. 30. Ishkanian AS, Malloff CA, Watson SK, DeLeeuw RJ, Chi B, Coe BP, Snijders A, Albertson DG, Pinkel D, Marra MA, Ling V, MacAulay C, Lam WL. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nat Genet 2004;36:299-303 31. Vissers LE, de Vries BB, Osoegawa K, Janssen IM, Feuth T, Choy CO, Straatman H, van der Vliet W, Huys EH, van Rijk A, Smeets D, van Ravenswaaij- Arts CM, Knoers NV, van der Burgt I, de Jong PJ, Brunner HG, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Veltman JA. Array-based comparative genomic hybridization for the genomewide detection of submicroscopic chromosomal abnormalities. Am J Hum Genet 2003;73:1261-70. 32. Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Microarray based comparative genomic hybridisation (array- CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J Med Genet 2004;41:241-8. 33. Schoumans J, Ruivenkamp C, Holmberg E, Kyllerman M, Anderlid BM, Nordenskjöld M. Detection of chromosomal imbalances in children with idiopathic mental retardation by array based comparative genomic hybridisation (array-CGH). J Med Genet 2005;42:699-705. 34. Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Emerging patterns of cryptic chromosomal imbalance in patients with idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of published reports. J Med Genet 2006;43:625-33. 35. Miyake N, Shimokawa O, Harada N, Sosonkina N, Okubo A, Kawara H, Okamoto N, Kurosawa K, Kawame H, Iwakoshi M, Kosho T, Fukushima Y, Makita Y, Yokoyama Y, Yamagata T, Kato M, Hiraki Y, Nomura M, Yoshiura K, Kishino T, Ohta T, Mizuguchi T, Niikawa N, Matsumoto N. BAC array CGH reveals genomic aberrations in idiopathic mental retardation. Am J Med Genet A 2006;140: 205-11 36. Stankiewicz P, Beaudet AL. Use of array CGH in the evaluation of dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardation Curr Opin Genet Dev 2007;17:182-92. 37. http://www.sanger.ac.uk/humgen/cnv 38. de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostic genome profiling in mental retardation. Am J Hum Genet. 2005;77:606-16. 39. Friedman JM, Baross A, Delaney AD, Ally A, Arbour L, Armstrong L, Asano J, Bailey DK, Barber S, Birch P, Brown-John M, Cao M, Chan S, Charest DL, Farnoud N, Fernandes N, Flibotte S, Go A, Gibson WT, Holt RA, Jones SJ, Kennedy GC, Krzywinski M, Langlois S, Li HI, McGillivray BC, Nayar T, Pugh TJ, Rajcan-Separovic E, Schein JE, Schnerch A, Siddiqui A, Van Allen MI, Wilson G, Yong SL, Zahir F, Eydoux P, Marra MA. Oligonucleotide microarray analysis of genomic imbalance in children with mental retardation. Am J Hum Genet 2006;79:500-13. 40. Aradhya S, Manning MA, Splendore A, Cherry AM. Whole-genome array-CGH identifies novel contiguous gene deletions and duplications associated with developmental delay, mental retardation, and dysmorphic features. Am J Med Genet A 2007;143:1431-41. 41. Ballif BC, Sulpizio SG, Lloyd RM, Minier SL, Theisen A, Bejjani BA, Shaffer LG. The clinical utility of enhanced subtelomeric coverage in array CGH. Am J Med Genet A 2007;143:1850-7. 42. Toruner GA, Streck DL, Schwalb MN, Dermody JJ. An oligonucleotide based array-CGH system for detection of genome wide copy number changes including subtelomeric regions for genetic evaluation of mental retardation. Am J Med Genet A 2007 ;143:824-9. 43. Vries BBA de, White SM, Knight SJL, Regan R, Homfray T, Young ID, Super M, McKeown C, Splitt M, Quarrel OWJ, Trainer AH, Niermeijer MF, Malcom S, Flint J, HURST JA, Winter RM. Clinical studies on submicroscopic subtelomeric rearrangements: a checklist. J Med Genet 2001;38:145-50. 44. Macayran JF, Cederbaum SD, Fox MA. Diagnostic yield of chromosome analysis in patients with developmental delay or mental retardation who are otherwise nondysmorphic. Am J Med Genet A 2006;140:2320-3. 45. Engels H, Brockschmidt A, Hoischen A, Landwehr C, Bosse K, Walldorf C, Toedt G, Radlwimmer B, Propping P, Lichter P, Weber RG. DNA microarray analysis identifies candidate regions and genes in unexplained mental retardation. Neurology 2007;68:743-50. 46. http://www.sanger.ac.uk/PostGenomic/decipher 47. Feenstra I, Fang J, Koolen DA, Siezen A, Evans C, Winter RM, Lees MM, Riegel M, de Vries BB, Van Ravenswaaij CM, Schinzel A. European Cytogeneticists Association Register of Unbalanced Chromosome Aberrations (ECARUCA); an online database for rare chromosome abnormalities. Eur J Med Genet 2006;49:279-91. 48. Newman WG, Hamilton S, Ayres J, Sanghera N, Smith A, Gaunt L, Davies LM, Clayton-Smith J. Array comparative genomic hybridization for diagnosis of developmental delay: an exploratory cost-consequences analysis. Clin Genet 2007;71:254-9. 49. Mandel JL, Chelly J. Monogenic X-linked mental retardation: is it as frequent as currently estimated? The paradox of the ARX (Aristaless X) mutations. Eur J Hum Genet 2004;12:689-93. 50. Madrigal I, Rodriguez-Revenga L, Badenas C, Sanchez A, Martinez F, Fernandez I, Fernandez- Buriel M, Mila M. MLPA as first screening method for the detection of microduplications and microdeletions in patients with X-linked mental retardation. Genet Med 2007;9:117-22. 51. Bauters M, Van Esch H, Marynen P, Froyen G. X chromosome array-CGH for the identification of novel X-linked mental retardation genes. Eur J Med Genet 2005;48:263-75. 52. Lugtenberg D, de Brouwer AP, Kleefstra T, Oudakker AR, Frints SG, Schrander-Stumpel CT, Fryns JP, Jensen LR, Chelly J, Moraine C, Turner G, Veltman JA, Hamel BC, de Vries BB, van Bokhoven H, Yntema HG. Chromosomal copy number changes in patients with non-syndromic X linked mental retardation detected by array CGH. J Med Genet 2006;43:362-70. 53. Berkenstadt M, Ries-Levavi L, Cuckle H, Peleg L, Barkai G. Preconceptional and prenatal screening for fragile X syndrome: Experience with 40 000 tests. Prenat Diagn 2007 Aug 17; _Epub ahead of print_ 54. Strom CM, Crossley B, Redman JB, Buller A, Quan F, Peng M, McGinnis M, Fenwick RG Jr, Sun W. Molecular testing for Fragile X Syndrome: lessons learned from 119,232 tests performed in a clinical laboratory. Genet Med 2007;9:46-51. 55. Hećimović S, Barišić I, Petković I, Barić I, Ligutić I, Pavelić K. Expand Long PCR for fragile X mutation detection. Clin Genet 1997;52:147-154. 56. Bittel DC, Kibiryeva N, Butler MG. Whole genome microarray analysis of gene expression in subjects with fragile X syndrome. Genet Med. 2007; 9:464-72. 57. Hećimović S, Barišić I, Pavelić K . DNA analysis of the fragile X syndrome in an at risk pediatric population in Croatia: simple clinical preselection criteria can considerably improve the cost-effectiveness of fragile X screening studies Hum Hered 1998;48:256-265. 58. Strom CM, Huang D, Li Y, Hantash FM, Rooke J, Potts SJ, Sun W. Development of a novel, accurate, automated, rapid, high-throughput technique suitable for population-based carrier screening for Fragile X syndrome. Genet Med 2007;9:199-207. 59. Berry-Kravis E, Abrams L, Coffey SM, Hall DA, Greco C, Gane LW, Grigsby J, Bourgeois JA, Finucane B, Jacquemont S, Brunberg JA, Zhang L, Lin J, Tassone F, Hagerman PJ, Hagerman RJ, Leehey MA. Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome: Clinical features, genetics, and testing guidelines. Mov Disord 2007 Jul 6; _Epub ahead of print_ 60. Jacquemont S, Hagerman RJ, Hagerman PJ, Leehey MA. Fragile-X syndrome and fragile X-associated tremor/ataxia syndrome: two faces of FMR1. Lancet Neurol 2007;6:45-55. 61. Philippe C, Villard L, De Roux N, Raynaud M, Bonnefond JP, Pasquier L, Lesca G, Mancini J, Jonveaux P, Moncla A, Chelly J, Bienvenu T. Spectrum and distribution of MECP2 mutations in 424 Rett syndrome patients: a molecular update. Eur J Med Genet 2006;49:9-18. 62. Matijević T, Knežević J, Barišić I, Čulić V, Rešić B. The MECP2 gene mutation screening in Rett syndrome patients from Croatia. Ann N Y Acad Sci 2006;1091:225-232 63. Zahorakova D, Rosipal R, Hadac J, Zumrova A, Bzduch V, Misovicova N, Baxova A, Zeman J, Martasek P. Mutation analysis of the MECP2 gene in patients of Slavic origin with Rett syndrome: novel mutations and polymorphisms. J Hum Genet 2007;52:342-8. 64. Harvey CG, Menon SD, Stachowiak B, Noor A, Proctor A, Mensah AK, Mnatzakanian GN, Alfred SE, Guo R, Scherer SW, Kennedy JL, Roberts W, Srivistava AK, Minassian BA, Vincent JB. Sequence variants within exon 1 of MECP2 occur in females with mental retardation. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 2007;144:355-60. 65. del Gaudio D, Fang P, Scaglia F, Ward PA, Craigen WJ, Glaze DG, Neul JL, Patel A, Lee JA, Irons M, Berry SA, Pursley AA, Grebe TA, Freedenberg D, Martin RA, Hsich GE, Khera JR, Friedman NR, Zoghbi HY, Eng CM, Lupski JR, Beaudet AL, Cheung SW, Roa BB. Increased MECP2 gene copy number as the result of genomic duplication in neurodevelopmentally delayed males. Genet Med 2006;8:784-92. 66. Villard L. MECP2 mutations in males. J Med Genet 2007;44:417-23. 9. 67. Klauck SM, Lindsay S, Beyer KS, Splitt M, Burn J, Poustka A. A mutation hot spot for nonspecific X-linked mental retardation in the MECP2 gene causes the PPM-X syndrome. Am J Hum Genet 2002;70:1034-7. 68. Lesca G, Bernard V, Bozon M, Touraine R, Gerard D, Edery P, Calender A. Mutation screening of the MECP2 gene in a large cohort of 613 fragile- X negative patients with mental retardation. Eur J Med Genet 2007;50:200-8. 69. Tejada MI, Penagarikano O, Rodriguez- Revenga L, Martinez-Bouzas C, Garcia B, Badenas C, Guitart M, Minguez M, Garcia-Alegria E, Sanz-Parra A, Beristain E, Mila M. Screening for MECP2 mutations in Spanish patients with an unexplained mental retardation. Clin Genet 2006;70: 140-4. 70. American Psychiatric Association: Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 4th edn. Washington DC, USA:American Psychiatric Association, 1995. 71. Chakrabarti S, Fombonne E. Pervasive developmental disorders in preschool children: confirmtion of high prevalence. Am J Psychiatry 2005;162: 1133-41 72. Katzov H. New insights into autism from a comprehensive genetic map. Clin Genet 2007;72:186-7. 73. Autism Genome Project Consortium. Mapping autism risk loci using genetic linkage and chromosomal rearrangements. Nat Genet 2007;39:319-28. 74. Wassink TH, Piven J, Patil SR. Chromosomal abnormalities in a clinic sample of individuals with autistic disorder. Psychiatr Genet 2001;11:57-63. 75. Wassink TH, Losh M, Piven J, Sheffield VC, Ashley E, Westin ER, Patil SR. Systematic screening for subtelomeric anomalies in a clinical sample of autism. J Autism Dev Disord 2007;37:703-8 76. Yurov YB, Vorsanova SG, Iourov IY, Demidova IA, Beresheva AK, Kravetz VS, Monakhov VV, Kolotii AD, Voinova-Ulas VY, Gorbachevskaya NL. Unexplained autism is frequently associated with low-level mosaic aneuploidy. Med Genet 2007;44:521-5. 77. Martin CL, Ledbetter DH. Autism and cytogenetic abnormalities: solving autism one chromosome at a time. Curr Psychiatry Rep 2007; 9:141-7. 78. Battaglia A, Bonaglia MC. The yield of subtelomeric FISH analysis in the evaluation of autistic spectrum disorders.Am J Med Genet C Semin Med Genet 2006 15;142:8-12. 79. Smith M, Escamilla JR, Filipek P, Bocian ME, Modahl C, Flodman P, Spence MA. Molecular genetic delineation of 2q37.3 deletion in autism and osteodystrophy: report of a case and of new markers for deletion screening by PCR. Cytogenet Cell Genet 2001;94:15-22. 80. Buxbaum JD, Cai G, Chaste P, Nygren G, Goldsmith J, Reichert J, Anckarsater H, Rastam M, Smith CJ, Silverman JM, Hollander E, Leboyer M, Gillberg C, Verloes A, Betancur C. Mutation screening of the PTEN gene in patients with autism spectrum disorders and macrocephaly. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 2007;5:144:484-91. 81. Herman GE, Henninger N, Ratliff-Schaub K, Pastore M, Fitzgerald S, McBride KL. Genetic testing in autism: how much is enough? Genet Med 2007;9:268-74.