Značenje eozinofilnih leukocita u djece s astmom

Eozinofili imaju ključnu ulogu u patofiziologiji astme, a eozinofilija u astmatičara u relaciji je s prekomjernom produkcijom citokina Th2-tipa. Pod utjecajem nekih citokina (IL-5, GM-CSF, IL-3) eozinofili se aktiviraju, poprimaju hipodenzni fenotip (gustoća << 1.093 g/ml), jače otpuštaju svoje toksične granule: eozinofilni kationski protein, eozinofilna peroksidaza, glavni bazični protein, neurotoksin deriviran iz eozinofila, eozinofilni protein X, te su odgovorni za citotoksičnost, što značajno korelira sa simptomima astme. Kako su eozinofilni leukociti involvirani djelomično kao upalne stanice i u nereaginskoj astmi, ispitali smo odnos tkivne i krvne eozinofilije u 248-ero djece s reaginskom astmom i 129-ero djece s nereaginskom astmom. U skupini djece s reaginskom astmom 86,7% imalo je prisutnu tkivnu eozinofiliju, 65,7% eozinofiliju u perifernoj krvi, dok je u ispitanika s nereaginskom astmom 18,6% imalo tkivnu eozinofiliju, a 20,9% eozinofiliju u perifernoj krvi. Razlika između dvije ispitane skupine djece statistički je značajna; p<< 0,001. Izrazito visoke vrijednosti tkivne i periferne eozinofilije nije imalo niti jedno dijete iz skupine s nereaginskom astmom. Na temelju spoznaje da eozinofili pod utjecajem IL-5 sudjeluju i u nereaginskoj astmi, dobiveni rezultati mogu navesti na zaključak da se na temelju već samo ovih nalaza grubo može procijeniti etiologija astme
UVOD @BODY = Eozinofili su važne efektorske stanice u patogenezi astme. Nađeni su u povećanu broju u mišićnom sloju i hrskavici. Poznato je da povećanje broja eozinofila u perifernoj krvi, u sputumu i u tkivima često prati alergijske i nealergijske astmatske napadaje (1-21). Eozinofili su moćne upalne stanice s mogućnošću proizvodnje bronhokonstriktornih agensa, leukotriena C4 i faktora aktivacije trombocita (platelet activating factor - PAF) (13-17, 22), pa neki autori povezuju stupanj krvne eozinofilije s težinom astme (23, 24, 25). Poznato je da eozinofili luče različite medijatore, bilo da se oni u njima već nalaze ili nastaju u trenutku reakcije (2, 13-17, 26). Eozinofilima se pripisuje bitna upalna funkcija, te su oni ključne stanice odgovorne za upalu dišnih putova u astmi (22, 11, 12, 14, 22). Eozinofilija se pripisuje otpuštanju eozinofila iz retikuloendotelnog sustava pod utjecajem citokina koji u cirkulaciju dolaze iz dišnih putova. Djelovanjem alergena oslobađaju se različiti medijatori koji stimuliraju stvaranje eozinofila, kao npr. GM-CSF, IL-3, IL-5, te čimbenici koji se oslobađaju iz epitelnih stanica (14-16, 21, 23, 27) što pomaže proliferaciju i dozrijevanje eozinofila, oslobađanje iz stanica koštane srži te pripremu za aktivaciju (28). IL-5 je selektivni eozinofilni kemotaktički faktor i utječe na eozinofilnu diferencijaciju i degranulaciju, a odgovoran je za mobilizaciju eozinofila (21, 29). IL-5 pomaže sazrijevanje eozinofila i produžuje im život (15, 30). Postoji značajna korelacija između broja stanica s izraženom mRNA za IL-4, IL-5 i GM-CSF i težine bronhalne preosjetljivosti, iz čega proizlazi zaključak da ovi citokini pridonose upali dišnih putova i težini kliničke slike. IL-4 i IL-5 mRNA udružene su s T-limfocitima, stoga Th-tip CD4 T-stanica ima važnu ulogu u kasnom astmatskom odgovoru. Nove studije (21, 31) objavljuju da je osim nazočnosti eozinofilije važna i aktivacija eozinofilnih stanica (31). Tu su uključeni isti citokini koji pojačavaju eozinofiliju: IL-5, GM-CSF i IL-3. Oni proizvode hipodenzne (gustoća manja od 1,093 g/ml) ili aktivirane eozinofilne leukocite (31). Dokazano je da eozinofili astmatičara imaju manju gustoću stanice (hipodenzitet) nego eozinofili zdravih osoba (32). Eozinofilija u BAL-u i u perifernoj krvi astmatičara izražava visokoafinitetni receptor za IgE, FcRII (CD32), CD11a, CD45 i CD23. Aktivirani eozinofili fenotipski se razlikuju u BAL-u i perifernoj krvi. Eozinofiliju u BAL-u regulira ekspresija ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1 - međustanična adhezijska molekula 1), LFA-3 (lymphocyte function antigen 3 - funkcijski limfocitni antigen 3) i HLA II (human leucocyte antigen II, humani leukocitni antigen II), što omogućuje stanično-stanični kontakt s T- limfocitima. ktivirani eozinofili imaju poveća<%0>n potrošak kisika, povećanu fagocitoznu i citotoksičnu aktivnost te povećanu sposobnost oslobađanja aktivnih produkata iz granula. Luče niz lipidnih tvari (PAF, LTB4, LTC4) (13, 15). Njihova sposobnost lučenja LTC4 znatno je veća nego kod drugih upalnih stanica (12, 33). Aktivirani eozinofili otpuštaju svoje granule koje su odgovorne za citotoksičnost i koje značajno koreliraju s kliničkim simptomima astme (21, 24). To su: major basic protein (MBP), eosinophil cationic protein (ECP), eosinophil peroxidase (EPO) ili myeloperoxidase (MPO), eosinophil derived neurotoxin (EDN) ili eosinophil protein X (EPX) (11, 14, 35-37). Imunoglobulini djeluju na degranulaciju eozinofila, pa je tako sekretni IgA najmoćniji u uzrokovanju eozinofilne degranulacije (22).
Eozinofili mogu otpuštati lipidne medijatore koji potencijalno mogu stimulirati i inhibirati otpuštanje sluzi iz dišnih putova (11, 12, 25, 38). Ostale molekule prisutne u eozinofilima su Charcot-Leydenovi kristali, proteini koji imaju lizofosfolipaznu djelatnost, iako su bazofili bogatiji u sadržaju tih molekula. Tako zajednička pojava proteina Charcot-Leydenovih kristala u eozinofilnim i bazofilnim leukocitima upućuje na povezanost eozinofila i bazofila. Eozinofili su toksičniji i od neutrofila, pa sami pokazuju i osobine ubilačkih stanica (natural killer, NK).
Eozinofili svojom toksičnošću mogu oštetiti mnoga tkiva, uključujući endokard, te izazvati vaskularnu disfunkciju koja može biti uzrok smrti astmatičnih bolesnika. Eozinofili posjeduju beta 2-adrenergičke receptore koji su funkcionalno aktivni, ali njihova aktivacija ne utječe na degranulaciju eozinofila i oslobađanje aktivnih tvari koje mogu oštetiti respiracijski epitel, što je nepoželjno kod astme (40).
Možemo zaključiti da eozinofili s jedne strane oštećuju okolno tkivo produktima svojih granula, a s druge strane proizvode faktore koji izazivaju bronhokonstrikciju, kemotaksiju, povećanu propusnost i dilataciju krvnih žila (11-13, 33, 41). Na taj način višestruko pokreću astmatski proces. Postojeća upala u astmi, s obzirom na ulogu eozinofila, nazvana je “kroničnim deskvamativnim eozinofilnim bronhitisom” (2, 27).
ISPITANICI I METODE
Ispitano je 377-ero djece u dobi od 2 do 15 godina s opetovanim bronhoopstruktivnim krizama (248 s alergijskom astmom i 129 s nealergijskom astmom).
Broj eozinofila u perifernoj krvi određen je razmazom kapilarne krvi na stakalcu, koje se boji po May-Grünwaldu, a zatim se diferencira broj eozinofila. Normalno se nađe 1 - 5 eozinofila na 100 leukocita. U ovom ispitivanju obuhvaćena su djeca s brojem eozinofila većim od 5. Apsolutni broj eozinofila (po Dungeru) određuje se tako da se kapilarna krv stavi u melanžer za leukocite do oznake 1, a Dungerova otopina (1 ml acetona, 1 ml eozina, 8 ml destilirane vode) do oznake 11. Dobro se izmješa, ostavi 20 min. da bi se eozinofilni granulociti obojali, te se stavi u Bürk-Türkovu komoricu i pod malim povećanjem broji pod mikroskopom. Normalno se nađe 250-300 × 109/L.
Tkivnu (sluzničku) eozinofiliju odredili smo tako što smo s pomoću vatiranog štapića zagrebli nazofarinks i materijal nanijeli na stakalce, koje se tada oboji po Hinkelmanu. Otopinom koja sadržava eozin 0,5 g, formaldehid 41% 0,5 ml i fenol 95% 0,5 ml, prelije se naneseni materijal iz nazofarinksa na stakalcu, te se nakon 30 sekundi ispere destiliranom vodom i osuši, kapne se cedrovo ulje, stavi u mikroskop pod imerziju, te se diferenciraju eozinofili i broje na 100 neutrofilnih granulocita. Dobiveni rezultat izražava se kao postotak eozinofila na broj neutrofilnih granulocita, a normalne vrijednosti su 0 - 5%.
Alergijsku astmu dokazali smo anamnestičkim podacima, kliničkim ispitivanjem, laboratorijskom dijagnostikom i utvrđivanjem apsolutnog (po Dungeru) i relativnog (%) broja eozinofilnih leukocita u perifernoj krvi, utvrđivanjem tkivne eozinofilije iz brisa nazofarinksa, kožnim testovima (prick metodom, standardnim preparatima za testiranje Imunološkog zavoda u Zagrebu), određivanjem ukupnih (RIST) i alergen - specifičnih (RAST) IgE protutijela u perifernoj krvi te u kooperabilne djece iznad 6 godina starosti i funkcionalnim plućnim testovima.
REZULTATI
Od 377-je ispitane djece, 190-ero (50,4%) imalo je eozinofiliju u perifernoj krvi (koeficijent varijabilnosti KV = 10,8%, a varijanca E2 = 1,17). U skupini 248-ero djece s reaginskom astmom eozinofiliju u perifernoj krvi imalo je 163-je (65,7%), a u skupini 129-ero djece s nereaginskom astmom eozinofilija u perifernoj krvi zabilježena je u 27-ero (20,9%) bolesnika (slika 1). Postoji statistički značajna razlika u broju eozinofila iz periferne krvi u djece s reaginskom u odnosu na djecu s nereaginskom astmom (c2 = 68,07, df = 2, p << 0,01).
Tkivnu (sluzničku) eozinofiliju imalo je 139 (64,4%) od ukupno 377 ispitanika. 215 (86,7%) iz skupine 248-ero djece s reaginskom astmom i 24 (18,6%) od 129-ero djece s nereaginskom astmom (slika 2). Razlika je statistički značajna (c2 = 171, df = 1, p << 0,01). Posebno je analiziran postotak tkivne eozinofilije u obje ispitivane skupine (slika 3), gdje se jasno može uočiti razlika između skupine djece s reaginskom u odnosu na djecu s nereaginskom astmom (slika 4). Veliki broj i postotak eozinofila u tkivu jasno upućuje na njihovu važnost u dijagnostici reaginske astme. Usporedili smo visinu postotka tkivne eozinofilije i učestalosti napada u reaginskoj i nereaginskoj astmi tijekom godine. Uvidjelo se da djeca s većim postotkom tkivne eozinofilije imaju i teže napadaje bronhoopstrukcije tijekom godine, što je vidljivo na tablici 1. Iz toga se može zaključiti da je intenzitet tkivne eozinofilije važan faktor za procjenu težine bolesti. Slika 5 prikazuje usporedbu nalaza apsolutnog i relativnog broja eozinofila u perifernoj krvi, kao i tkivne eozinofilije iz brisa nazofarinksa.
Relativan broj eozinofila u perifernoj krvi (>> 5%) bio je nazočan u skupini djece s reaginskom astmom u 163-je (65,7%) djece, a u ispitanika s nereaginskom astmom u 27-ero (20,9%). Razlika je statistički značajna (t = 5,96, df = 1, p << 0,01).
Apsolutan broj eozinofila u perifernoj krvi ( 350 × 109 registriran je u 181 djeteta (73,0%) s reaginskom astmom te u 29-ero (22,5%) s nereaginskom astmom, što je statistički značajno (t = 6,32, df =1, p<< 0,01).
Tkivnu eozinofiliju veću od 5% imalo je 215-ero (86,7%) djece s reaginskom astmom te 24-ero (18,6%) s nereaginskom astmom. Statistički je značajna razlika između dvije ispitivane skupine (t= 7,61, df =1, p << 0,01).
RASPRAVA
Eozinofilija je jedno od najvažnijih obilježja alergijske astme. Eozinofili imaju dvostruko djelovanje: s jedne strane svojim toksičnim granulama oštećuju tkivo, a s druge strane luče arilsulfatazu kojom inaktiviraju SRS-A supstanciju, N-histamilazu za histamin i fosfolipazu D, koja neutralizira PAF. Eozilnofilni inhibitor degranulacije (EDI) neutralizira slobodni histamin i prostaglandin F2 alfa. Eozinofili fagocitiraju komplekse antigen-protuntitijelo, dakle, imaju funkciju NK stanica. Eozinofili direktno inhibiraju antigensku stimulaciju, jer i oni imaju receptore za IgE. Za eozinofiliju u astmi odgovoran je IL-5 (19-21, 31). Za akumulaciju eozinofila na mjestima alergijske upale potrebno je nekoliko mehanizama: produkcija IL-4, regulacija specifičnih adhezijskih molekula na eozinofilima i endotelu, prekomjerna produkcija aktivnih citokina koji produžuju život eozinofila i pomažu njihovo pritjecanje (20). Eozinofilija u astmatičara u relaciji je s prekomjernom produkcijom citokina Th2-tipa (20, 31).
Od ukupnog broja ispitanika eozinofiliju u perifernoj krvi veću od 5% imalo je 50,4% djece. Analizirajući zasebno eozinofiliju među djecom s alergijskom i nealergijskom astmom uočili smo znatno viši postotak (65,7%) u skupini s alergijskom astmom (p << 0,01), u odnosu na nealergijsku astmu gdje je eozinofilija registrirana u 20,9% ispitanika.
Eozinofiliju u perifernoj krvi višu od 20% imalo je 5,6% djece. Eozinofiliju u krvi od 5 do 10% imalo je 39,5% djece s alergijskom astmom te 17,0% djece s nealergijskom astmom. Eozinofiliju u perifernoj krvi između 11-15% imalo je 10,1% djece s alergijskom astmom, te 1,5% djece s nealergijskom, a eozinofile od 16 do 20% imalo je 11,3% ispitanika s alergijskom astmom te 1,6% djece s nealergijskom astmom. Više od 20% eozinofila u perifernoj krvi imalo je 4,8% djece s alergijskom astmom te 0,8% djece s nealergijskom astmom. Vidljivo je da su eozinofili u perifernoj krvi znatno više bili povišeni u skupini djece s alergijskom astmom (p << 0,001). Apsolutan broj eozinofila (po Dungeru) bio je povišen (više od 350 × 109/L) u 55,7% od ukupnog broja ispitanika. U skupini djece s alergijskom astmom bilo ih je znatno više (73,0%) u odnosu na one s nealergijskom astmom gdje ih je bilo 22,5% (p << 0,01). Vrlo visoki broj eozinofila (1000 × 109/L) imalo je 4,0% djece. Ovi dobiveni rezultati jasno govore o razlici u broju i postotku eozinofila u perifernoj krvi u djece s alergijskom i nealergijskom astmom. Već na temelju ovih nalaza moglo bi se grubo procijeniti o etiologiji astme.
S obzirom na činjenicu da se promjene na sluznici donjih dišnih putova odražavaju na sluznici gornjih dišnih putova, može se umjesto pregleda BAL-a uzeti bris nazofarinksa.
Eozinofili uzeti iz nazalne sekrecije pokazuju sličnu citološku sliku kao i sekret bronha, a metoda je mnogo jednostavnija, ne traumatizira dijete, može se raditi u svako doba dana bez obzira na uzimanje hrane. Prilaz dijagnostici je bolji nego određivanje broja eozinofila iz periferne krvi, jer su eozinofili pretežno tkivne stanice, a njihov broj može biti povećan u tkivima i bez popratnog povećanja u perifernoj krvi (42). Analiza je pogodnija, jer se izvodi in vitro, uzimanje i tehnika su jednostavni, ne zahtijeva skupu aparaturu, a rezultat se brzo dobije. Zbog svoje jednostavnosti može se rabiti u ambulanti kao pomoćna dijagnostička metoda za astmu djece svih dobi. Eozinofili se normalno u nazalnom sekretu ne nalaze, ili ih ima u tragu. Eozinofilija se u nazofarinksu češće nalazi u težim oblicima astme (43), a značajna je pojava u alergiji na pelud, kućnu prašinu i druge alergene, dok se u infektivnoj astmi ne nalaze (44). Na žalost nismo mogli provesti pretragu denziteta eozinofila koja bi nam dala bolji uvid u funkcionalne sposobnosti, nego smo se koristili metodom tkivne eozinofilije. Manifestna ili prikrivena infekcija, osobito gornjega respiracijskog trakta, može biti razlog privremeno smanjene eozinofilije iz nazofarinksa u astmatske djece, a kada infekcija prođe, eozinofili se povisuju. Ovu činjenicu valja imati na umu pri negativnom rezultatu, stoga je potrebno da se pretraga ponovi nakon što su prošli znakovi infekcije.
Povećani broj eozinofilnih leukocita u brisu nazofarinksa imalo je 86,7% djece s alergijskom astmom, te 18,6% djece s nealergijskom astmom iz čega se zaključuje važnost prisutnosti tkivne eozinofilije u dijagnostici alergijske astme (p<< 0,01). Mjerili smo postotak tkivne eozinofilije u odnosu na neutrofilne leukocite svrstavajući ih u nekoliko razreda i usporedili skupinu djece s alergijskom i nealergijskom astmom. 5-10% eozinofilnih leukocita u brisu nazofarinksa imalo je 19,4% djece s alergijskom te 14,0% djece s nealergijskom astmom. 11-20% imalo je 33,5% djece s alergijskom te 0,8% s nealergijskom astmom. 21-30% eozinofila u nazofarinksu imalo je 9,7% djece s alergijskom astmom, a niti jedno dijete u skupini s nealergijskom astmom. 31-40% eozinofila u nazofarinksu imalo je 6,9% djece s alergijskom astmom i 0,8% djece s nealergijskom astmom. Broj i postotak tkivne eozinofilije značajno se razlikuje u skupini ispitanika s alergijskom astmom u odnosu na one s nealergijskom astmom (p<< 0,01). Budući da su ove pretrage vršene u tzv. “mirnoj fazi” kada dijete tijekom 14 dana nije imalo napadaja teškog disanja niti je primalo ikakvu terapiju, ove rezultate smatramo osjetljivim parametrom karakterističnim za alergijsku astmu. Zanimala nas je visina postotka tkivne eozinofilije uspoređena s težinom bolesti koju smo ocijenili učestalošću napada bronhoopstrukcije tijekom godine te usporedili djecu s alergijskom i nealergijskom astmom. Uvidjeli smo da je bolest teža u djece s većim postotkom tkivnih eozinofila, pa se tim parametrom može kritički ocijeniti težina, pa i prognoza bolesti. Ovaj se zaključak ne odnosi na skupinu djece s nealergijskom astmom, gdje gotovo da nema djece s visokim postotkom tkivnih eozinofila i većim brojem napadaja. Iako su eozinofilni leukociti involvirani djelomično kao upalne stanice i u nealergijskoj astmi, ipak je vidljivo da je njihova važnost daleko veća u alergijskoj astmi. Osobito sudjeluju u upalnim promjenama sluznice koju oštećuju svojim toksičnim produktima. Pri uzimanju brisa nazofarinksa treba obratiti pažnju da dijete ne prima terapiju, jer je dokazano da eozinopenija može biti rezultat primjene lijekova kao što su epinefrin, aminofilin, kortizol, izoproterenol (45). Poznato je da eozinofili migriraju za vrijeme akutnog napadaja u šokno tkivo (2), te u krvi nastaje eozinopenija.
Da bismo potvrdili ovu činjenicu, u 84-ero svojih ispitanika za vrijeme akutnog astmatskog napadaja uzeli smo iz nazofarinksa bris na eozinofilne leukocite. Uočili smo značajan pad, ili pak nestajanje tkivnih eozinofila u 58-ero (69%) djece, a u 49-ero (58,3%) pad eozinofila u krvi, što navode i drugi autori (46-48).
65,7% djece s reaginskom astmom imalo je eozinofiliju periferne krvi, 86,7% tkivnu eozinofiliju, a izrazito visoke vrijednosti krvne i tkivne eozinofilije imalo je 9,8% ispitane djece. Djeca s nealergijskom astmom imala su sve ove parametre znatno niže. Tako je perifernu eozinofiliju imalo 20,9% djece, tkivnu eozinofiliju 18,6%, a izrazito visoke vrijednosti svih ovih parametara nije imalo nijedno dijete iz skupine s nealergijskom astmom. Ovi rezultati jasno pokazuju osobiti značaj eozinofilnih leukocita u alergijskim imunološkim zbivanjima.
ZAKLJUČAK
U Alergološkoj ambulanti Službe za zaštitu zdravlja djece Opće bolnice "Dr. Josip Benčević" u Slavonskom Brodu ispitana je neselekcionirana skupina od 377-ero djece dobi od 3 do 15 godina (240 dječaka i 137 djevojčica) u kojih je utvrđena dijagnoza bronhalne astme.
Tkivna (sluznička) eozinofilija iz brisa nazofarinksa (>> 5%) utvrđena je u ovom radu u 86,5% djece s alergijskom astmom. Intenzitet tkivne eozinofilije je prema dobivenim rezultatuima značajni čimbenik u procjeni težine bolesti. Jednostavna izvedba i neinvazivnost pretrage govore u prilog korištenju ovog parametra kao skrining metode u ambulantnom radu u praćenju djece s alergijskom astmom.
Praćenje eozinofilije u perifernoj krvi i u brisu nazofarinksa može poslužiti kao dobar pokazatelj uspješnosti provedenog liječenja, ali se samo na temelju ovih pretraga ne može predvidjeti prognoza bolesti.