Suspenzija autolognih keratinocita u fibrinskom ljepilu - primijenjena kod opsežnih opeklina

Opisujemo naša rezultate u liječenju trinaestogodišnjeg dječaka koji je zadobio opsežne i duboke opekline strujom visokog napona koje su zahvaćale 75% tijela. Tad smo prvi put primijenili novu metodu za tretman teških opeklina i kroničnih rana, koristeći suspenziju autolognih keratinocita u fibrinskom ljepilu, engl. Keratinocytes -Fibrin-Glue-Suspension (KFGS). Autologni epidermni presadci uzgojeni in vitro uspješno su primijenjeni u praksi, te potvrđuju mogućnost da će se djeca s opsežnim i dubokim opeklinama u Hrvatskoj moći liječiti i ovom naprednom i učinkovitom metodom. UVOD
Zacjeljivanje rana nastalih uslijed opeklina znači niz biloških procesa koji se događaju u organizmu. Kao rezultat toga, zbrinjavanje opeklina je važan klinički i ekonomski problem.
Najveći doprinos zacjeljivanju kronič nih rana dali su istraživači R h i n - w a l d i G r e e n koji su još 1975. godine uspješno kultivirali epidermne transplantate, tj. kulturu epidermnih presadaka (engl. cultured epidermal autografts- CEA), od pojedinačnih stanica u suspenziji do stratificiranih humanih presadaka. To je novi suvremeni način lije- čenja pacijenata i ta nova tehnologija primjenjuje se u gotovo svim razvijenim zemljama, jer bolesnicima pomaže u pre- življavanju, smanjuje mogućnost razvijanja sepse i boli, uspostavlja termoregulaciju, sprječava dehitrataciju.
Keratinociti se mogu uzgajati u in vitro uvjetima i kao jednoslojna stanična kultura u mediju bez seruma s malom koncentracijom kalcija (engl. defined keratinocytes serum-free medium DKSFM) bez stvaranja dezmosomalnim unutranjih veza i feeder layera. Prva uspješna klinič ka primjena bila je 1979./1980. kad su N i c h o l a s E . O ’ C o n n o r i J o h n M i l l i k e n testirali epidermalne presatke na teško opečenim odraslim osobama u Bostonu u Peter Bent Brigham Hospital (sada Brigham and Women’s). Aplikaciju suspenzije keratinocita u fibrinskom ljepilu prvi put su opisali H u n y a d i i sur. 1988. godine na venskim ulceracijama.
Autologni epidermalni presadci uzgojeni in vitro uspješno su prvi put primijenjeni u Hrvatskoj na teško opečenoj djeci u Klinici za dječje bolesti Zagreb, zahvaljujuć i angažiranju dr. Z. V r t a r a , šefa Odjela opeklina, plastične i rekonstruktivne kirurgije u Zagrebu, koji je sura- đivao sa stručno osposobljenim timom iz Bratislave, Slovačka, Klinika Ružinov (dr. sc. J a n K o l l e r , dr. sc. E v a P a - n a k o v a), koji su i proizveli te presatke. Dana 22. svibnja 2003. godine Ministarstvo zdravstva Republike Hrvatske dalo je suglasnost za osnivanje Laboratorija za autologne presatke koje se temeljilo na pozitivnom mišljenju Bioetičkog povjerenstva RH.
Prvi slučajevi proizvodnje presadaka in vitro u Republici Hrvatskoj učinjeni su zahvaljujuć i organiziranju osoblja sa KBC-a Rebro (Transfuzija), koji su ustupili svoje prostorije za sterilan rad, Klinike za dječje bolesti Zagreb, (četvero teško opečene djece) i Klinike za Traumatologiju koja je imala stručno osposobljene djelatnike za taj posao. Sve je temeljeno na entuzijazmu, dobroj volji osoblja i novcu što ga je odobrilo Ministarstvo znanosti kao početni projekt “Proizvodnje epidermalnih presadaka in vitro”. Predkliničko ispitivanje započelo je još tijekom 1996./1997. godine u Laboratoriju za eksperimentalnu imunologiju, hematologiju i onkologiju Instituta “Ru- đer Bošković” u Zagrebu, u suradnji s voditeljem laboratorija prof. dr. sc. M i l i - v o j e m B o r a n i ć e m i patologinjom s KBC Rebra dr. sc. J a s m i n k o m J a - k i ć R a z u m o v i ć, koja je ovu tehniku naučila u Americi i prenijela ju u Hrvatsku. Kliničko ispitivanje započeto je u srpnju 2002. godine u suradnji s dr. H r - v o j e m T o m i č i ć e m, šefom Odjela opeklina Klinike za traumatologiju u Zagrebu, uz prethodnu suglasnost Upravnog vijeća, Povjerenstva za lijekove, Etičkog povjerenstva i Stručnog vijeća . U ovom našem radu opisan je takav slučaj na trinaestogodišnjem dječaku koji je u lipnju 2004. godine zadobio teške opekline što su zahvaćale 75% tijela. Tad smo prvi put primijenili novu metodu za tretman teških opeklina i kroničnih rana, rabeći suspenziju autolognih keratinocita u fibrinskom ljepilu, engl. Keratinocytes -Fibrin-Glue-Suspension (KFGS). Proces prodiranja topline dublje u tkiva i termičko oštećenje tkiva nastavlja se spontano, polako i dugotrajno i poslije prestanka djelovanja vanjske temperature koja je izazvala opeklinu. Posljedica toga je značajno duže trajanje toplinskog djelovanja na tkiva od samog trajanja djelovanja vanjskog agensa koji ga je uzrokovao. Ljudska koža može podnijeti temperature do 40°C relativno dugo vremena prije nego što nastupi vidljiva ozljeda. Temperature iznad ove vrijednosti uzrokuju logaritamski porast ozljede tkiva, odnosno svaki izravni dodir s predmetima ili sredstvima temperature više od 70°C uzrokuje opeklinu u dodirnom tkivu. Pri kontaktu tijela s visokonaponskom strujom od 25 000 V, zbog pretvaranja velikim dijelom električ ne u toplinsku energiju, opekline obuhvać aju i dublje strukture tkiva te izazivaju ostećenja unutarnjih organa.

MATERIJA I METODE
Kultivacija epidermnih stanica in vitro:
Epidermalne stanice smo uzgajali u Zavodu za Tranfuziju, KBC Rebro, Zagreb. Uzorak kože veličine 2x2 cm, debljine 0,3 mm dobili smo s dječakove prepone. Bioptat je potrebno preko noći staviti u enzim dispazu (Boehringer, Mannheim, Germany) kako bismo odvojili epidermis od dermisa. Enzimatskom razgradnjom dobiju se epitelne stanice: keratinociti koji se uzgajaju u bočicama s filterom 75 cm2 (tissue culture flasks, Sarstedt) na hranjivoj podlozi (engl. feeder layer), tj. ozračenim mišjim fibroblastima 3T3 (56 Gy 37 minuta). Dakle, stanice 3T3 su stanična linija mišjih fibroblasta prilagođena rastu u in vitro uvjetima koji služe kao potporni sloj keratinocita i zasijavaju se dan-dva prije keratinocita (slika 1).
Kultura keratinocita na feeder layeru rastu u inkubatoru na 37°C i 5 % CO2 te u hranjivom mediju - GM koji se sastoji od: DMEM – engl. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Imunološki zavod ili Life Technologies) HAM’s (Nutrient mixture HAM’s F-12, Life Technologies), telećeg seruma FBS (Fetal bovin serum), L-glutamina, (Life Technologies), kolera toksina (Cholera toxin –Vibrio Cholerae Calbiochem) kao i redom ABAM (Antibiotic/ Antimykotic solution ili Penicilin/ Streptomicyn), adenin, trijodtironin, inzulin i hidrokortizon iz Sigme. Ovako pripremljen medij upotrebljava se za propagaciju ljudskih keratinocita iz biopsije kože prva tri dana kultiviranja a nakon pojavljivanja prvih kolonija keratinocita u medij se dodaje epidermni faktor rasta - EGF (engl. Epidermal growth factor, Life Technologies), koji potiče proliferaciju i diferencijaciju keratinocita. Nekoliko dana nakon zasijavanja primarne kulture keratinocita, na potpornoj mreži fibroblasta koji pokrivaju dno kultivacijske posude, mogu se vidjeti kolonije keratinocita koje dosežu gustoću 60-70% za 7-10 dana kad nastane konfluentan sloj koji se presađ uje u nove kulture. Na taj način površ ina keratinocitnog sloja eksponencijalno raste: nakon 3-4 pasaže do 1 m2 . Nakon odvajanja stanica od dna bo- čica koristeći 0,02% Tripsin-EDTA (Gibco) i cetrifugiranjem 4 minute 1100 okr/min potrebno je zasijati ravnomjerno keratinocite gustoće 2 x 10 6 u nove bo- čice od 75 cm2 bez feeder layera sa 15 mL medija bez seruma, DKSFM (engl. Defined Keratinocytes serum-free medium; Gibco). Nakon konfluencije 60-70% i resuspendiranja keratinocita u mediju DKSFM potrebno je aplicirati kombinaciju suspenzije keratinocita u fibrinskom ljepilu "tyssuecol”, primjenjujući novu metodu KFGS.

REZULTATI
Koristili smo bioptat trinaestogodiš njeg dječaka, čije su epidermne stanice imale veću moć dijeljenja i veći proliferacijski kapacitet u odnosu na pacijente starije životne dobi. Rast keratinocita kao i broj udvostručenih populacija ovisi od dobi pacijenta (koža od dojenčeta ima najveću mogućnost dijeljenja 50-60 populacijskih udvostručavanja, no taj broj opada s godinama pacijenata). Bilo da keratinociti rastu u mediju sa serumom ili bez njega, brzina staničnog ciklusa je svaka 22-24 sata. Ako to usporedimo s keratinocitima in vivo, tj. u normalnom epidermisu, stanični ciklus varira od 50 prema 300 sati (slika 2).
Nekoliko dana nakon primjene kulture keratinocita u fibrinskom ljepilu KFGS pojavili su se prvi znaci epitelizacije (slika 3). Iako smo upotrijebili KFGS bez primjene alotrasplantata na opeklinu, prepoznaje se višeslojni epitel.

RASPRAVA
Pacijentima s opsežnim opeklinama limitirano je pokrivanje tijela slobodnim kožnim presadcima djelomične debljine (engl. split thickness skin graft STSG). Mogućnost primjene tog postupka ovisi o omjeru između ozlijeđenog i neozlijeđ enog područja i bolesnikova općeg stanja. Uzimanje autotrasplantata uzrokuje dodatnu bol, povećava se ogoljena povr- šina tijela i ostavlja ožiljke. Ako nismo u mogućnosti rabiti autotrasplantate STSG, onda se u tom slučaju primjenjuju suvremne tehnike tkivnog inženjerstva kao što je uzgoj keratinocita u uvjetima in vitro ili komercijalno dostupna sintetska koža. Za teško opečene pacijente iz Hrvatske naručivali su se epidermni presadci iz inozemstva, što je još više poskupljivalo ionako skupu tehniku lije- čenja.
Ako je riječ o dubokim i opsežnim opeklinama, gdje je zahvaćena cijela debljina kože do masnog tkiva ( III. stupanj ), gdje nema matičnih epidermnih stanica, do reepitelizacije će doći samo od rubova defekta prema sredini. Tako opisane opsež ne i duboke opekline koje su zahvatile tijelo trinaestogodišnjeg dječaka morali smo zbrinjavati jednom od suvremenijih metoda tkivnog inženjerstva. Budući da u Klinici za dječje bolesti Zagreb na godinu primamo 2-3 takva pacijenta s teškim i opsežnim opeklinama, imamo iskustvo, jer smo bili u mogućnosti pomoći pacijentima s uzgojem epidermnih autolognih presadaka CEA, što nam je i sad bila namjera. Međutim, imali smo tehničke poteš koće (nedostatak dovoljnog broja stanica 3T3 kao hranjive podloge i njihovo otežano zračenje), pa smo odlučili primijeniti novu metodu suspenzije autolognih keratinocita u fibrinskom ljepilu KFGS (slika 4).
Više od dva desetljeća u svijetu se primjenjuje kultura epidermnih presadaka CEA kao stratificirani epidermis. Ova je tehnika i komercijalno dostupna, ali vrlo je skupa i mora se čekati 3-4 tjedna da bi se proizveli presadci. Poteškoće stvara i zahtjevna tehnika uzgoja presatka CEA i sposobnost rukovanja s vrlo nježnim presatkom. Isto tako treba istaknuti da je adherentnost presatka varijabilna od 20-80%. Ako se usporedi s novom tehnikom suspenzije keratinocita s fibrinskim ljepilom, prednosti te metode su ove: opeklina se ranije zbrinjava jer su stanice prije dostupnije, metoda je jeftinija i jednostavnija za primjenu (slika 5).

ZAKLJUČAK
Treba istaknuti da je budućnost suvremene medicine u tkivnom inženjerstvu pa samim tim i zbrinjavanje teških opeklina. Nema sumnje da metode kao što su kulture autolognih presadaka (CEA) i kultura suspenzije keratinocita (KFGS) daju dobre rezultate u zbrinjavanju :
– teških opeklina (više od 30% tjelesne površine, II. i III. stupanj), tada je CEA i KFGS u fukciji očuvanja ljudskog života.
– kožnih promjena u pacijenata s bolešć u epidermolysis bullosa
– kroničnih kožnih defekata - rane nastale uslijed dekubitalnih, venoznih i dijabetičnih ulceracija.
U Americi su ulceracije stopala kod dijabetičara odgovorne za više od 50,000 amputacija na godinu.

LITERATURA
1. Opća anatomija-Križan 177-179, Temelji anatomije čovjeka-Keros, Bagi, Pećina 1987g. str. 237, Anatomija čovjeka-Krmpotić 514-517, Hematologija, Labar.
2. Hunyadi J, Farkas B, Bertenyi C, Olah J, Dobozy A. Keratinocytes grafting: a new means of trasplantation for full-thickness wounds. J Dermatol Surg Oncol 1998;14:75-8.
3. Horch R, Stark B, Kopp J. Histology after grafting of cultured keratinocyte-fibrin-glue-suspension (KFGS) with allogenic split-thickness-skin (STS) overlay. Burns 1994.
4. Altermatt S, Mueli M. Cultured keratinocytes for postburn scar revision. Plastic Surgery and Surgical Treatmen of Burns (Abstracts) 1994.
5. Staindl O. Fibrin sealing in plastic operation in the head and throat area. 35th Congress of Austrian Society for Surgery (Abstract) Salzburg/Austria, June 2nd-4th,1994.
6. Fei X. Rapid epithelial coverage with autologous and allogenic keratinocytes on bovine fibrin glue for burns. International Congress “Current Concepts” In Pediatric Burns Care, (Abstract) Zurich/Switzerland, October 16th-18th, 1996.
7. Bettermann A, Kage A, Buchholz R, Huebner H, Salomon A, Schneider C. Cultivation of human skin cells in fibrin microcapsules. Plastic Surgery and Surgical Treatment of Burns. Kongresno priopćenje, Berlin, 1996.
8. Jakić-Razumović J, Zekušić M, Vlahović-Relja T, Boranić M. Oragonotipic skin cultivation: a human model for basic studies. CMJ 1998;39:401-3.
9. Boranić M, Razumović J, Stanović S, Kljenak A, Fatorini I. Kultura kožnih stanica: primjena u pla- stičnoj kirurgiji i laboratorijskom istraživanju. Liječ Vjesn 1999;121:137-43.
10. Vrtar Z, Zekušić M, Barčot Z, Boranić M, Pre- žigalo J, Tominac M, Kljenak A. Treatment of severely burned children with cultured keratinocyte grafts. (Abstract) Klinika za dječje bolesti Zagreb, World Congress of Pediatric Surgery, Zagreb, 22.-27. lipanj 2004.
11. Erik Neovius B. Tissue engineering by cocultivating human elastic chondrocytes and keratinocytes. Mary Ann Liebert, Inc.-Tissue Engineering (Abstract) 2004;9:365.