Laboratorijska dijagnostika trombofilije

Ne postoji sveopće prihvaćena definicija trombofilije. Ovom se terminologijom služi uglavnom zato da bi se odredio poremećaj hemostaze koji povećava sklonost nastanka tromboze. Nešto novija definicija trombofiliju definira kao sklonost nastanku tromboze, kao posljedica predisponirajućih čimbenika koji mogu biti genetički određeni, stečeni ili oboje. U posljednje vrijeme definicija trombofilije obuhvaća i stanja koja nisu izravno povezana sa hemostatskim sustavom (npr. hiperhomocisteinemija) i klinički je najupotrebljivija. Kako god definirali trombofiliju, ona zasigurno može biti sekundarni događaj mnogih patoloških stanja. Nekoliko posljednjih godina izrazito je povećan pritisak na kliničke laboratorije u smislu utvrđivanja rizičnih čimbenika za nastanak tromboze. Cilj ovog preglednog članka je utvrditi situacije i stanja koja se mogu dovesti u vezu s trombofilijom, a isto tako razmotriti razumne testove koji bi se trebali primijeniti, zatim tko, kada i zašto bi se trebao testirati te na kraju plan testiranja koji bi bio i financijski opravdan. UVOD
Hemostaza je složen proces međusobno povezanih reakcija koji neprekidno štite organizam od gubitka krvi iz intravaskularnog prostora, a uključuje normalan odgovor krvnih žila, nastanak trombocitnog ugruška i aktivaciju koagulacijske kaskade. Aktivacijom čimbenika zgrušavanja koji sudjeluju u koagulacijskoj kaskadi nastaje aktivator protrombina, katalitič ki enzim koji pretvara protrombin u trombin. Trombin je ključni enzim koji djeluje na fibrinogen, pri čemu nastaje fibrin. Fibrinske niti su mreža u kojoj se zadržavaju trombociti i druge krvne stanice što rezultira nastajanjem ugruška. Suprotan mehanizam djelovanja imaju neoštećene stanice koje sprječavaju adheziju i agregaciju trombocita te neki proteini u plazmi. Protein trombomodulin nakon kompleksa s trombinom aktivira protein C (PC) koji zajedno sa proteinom S (PS) sudjeluje u inaktivaciji aktiviranih čimbenika zgrušavanja V (FVL) i VIII (FVIIIa). Antitrombin (AT) je najvažniji prirodni inhibitor sustava zgrušavanja koji u najvećoj mjeri inhibira aktivirane čimbenike zgrušavanja, FXa i trombin i u manjoj mjeri FIXa, FXIa i FXIIa. Prirodni inhibitori sustava zgrušavanja predstavljaju važan kontrolni mehanizam jer spriječavaju spontani početak zgrušavanja te ograničavaju širenje stvorenog ugruška izvan mjesta ozljede pa na taj način predstavljaju značajnu barijeru za nastanak tromboze (1). Čimbenici koji potiču hemostatski mehanizam ili inhibiraju mehanizme inhibicije koagulacije zajednički povećavaju stanje trombogeneze (hiperkoagulabilnosti), te ih zbog toga nazivamo protrombotič kim rizičnim čimbenicima.

PROTROMBOTIČKA STANJA
Trombozu karakterizira pojačano stvaranje ugruška u krvnim žilama (arterije, vene, kapilare) ili u šupljinama srca. Protrombotička stanja ili hiperkoagulabilna stanja su patološka stanja organizma koja uvjetuju sklonost trombozi (2). Takva su stanja u većini slučajeva rezultat poremeć aja zgrušavanja krvi, a mogu biti i posljedica drugih hematoloških poremeć aja, poremećaja funkcije trombocita ili oštećenja krvnih žila. U hemostatske poremećaje ubrajamo urođene ili stečene poremećaje prirodnog antikoagulacijskog ili fibrinolitičkog sustava. Oni u pravilu nastaju zbog hiperaktivnosti sustava zgrušavanja uslijed hipoaktivnosti antikoagulacijskih mehanizama ili smanjenog fibrinolitičkog potencijala. Do sada dobro utvrđeni čimbenici poviš enog rizika za vensku trombozu obuhvać aju genske poremećaje proteina vezane za regulaciju sustava zgrušavanja i fibrinolize (FV Leiden i mutacija gena za protrombin FII 20210A te nedostatak AT, PC i PS kao i druge nasljedne poremećaje (bolest srpastih stanica, hiperhomocisteinemiju te disfibrinogenemiju). Prema istraž ivanjima provedenim u posljednje vrijeme pokazano je da je i povišena vrijednost FVIII povezana s povećanim rizikom za nastanak venske tromboze. Mnogi stečeni poremećaji hemostaze su povezani sa specifičnim patološkim kliničkim stanjima kao što su maligne i mijeloproliferativne bolesti, talasemija, sistemski lupus eritomatodes, antifosfolipidni sindrom, bolesti jetre, nefrotski sindrom i hiperlipidemija. Trombotički događaji često nastaju nakon poticaja nekog od stečenih čimbenika povišenog rizika za trombozu (trauma, kirurški zahvat s produljenom imobilizacijom, pretilost sa sklonošću venske staze, trudnoća) tako da je najčešći slučaj kombinacija jednog ili više nasljednih i stečenih čimbenika (3). Klinički se ovi poremećaji najčešće očituju kao duboke venske tromboze (DVT) donjih ekstremiteta, s plućnom embolijom ili bez nje u više od 90% trombotič kih epizoda, dok se u manje od 5% javljaju kao tromboze mezenterijskih i moždanih vena. Do sada nije dokazana povezanost nasljednih poremećaja hemostaze i povećanog rizika za nastanak arterijske tromboze. Kod djece se protrombotič ki događaji u 20-50% slučajeva očituju kao arterijsko-ishemijski moždani udar (AIS), a u 33-99% kao sinovenska tromboza (SVT)(4). Novija istraživanja pokazuju da je hiperhomocisteinemija jedan od mogućih uzroka nasljedne trombofilije. Smatra se da su blaga i umjerena hiperhomocisteinemija za sada jedini poremeć aji koji mogu podjednako uzrokovati juvenilnu arterijsku i vensku trombozu. Učestalost u bolesnika s utvrđenom venskom trombozom kreće se od 10 – 19% (tablica 1) (5).


ZAŠTO, KOME I KADA TREBA ODREĐIVATI PROTROMBOTIČKE RIZIČNE ČIMBENIKE?
U trenutku akutnog trombotičkog događ aja nije presudno određivanje protrombotič kih rizičnih čimbenika jer rezultati ili uzrok trombotičkog događaja ne utječu na liječenje. Uvođenje antikoagulacijske terapije nakon akutnog trombotič kog događaja, utječe na rezultate nekih laboratorijskih testova (AT, PC, PS). Na taj se način može donijeti pogrješan zaključ ak o uzroku nastanka samog trombotič kog događaja. Određivanje protrombotič kih rizičnih čimbenika preporuča se učiniti do šest mjeseci nakon trombotič kog događaja. Potrebno ih je odrediti nakon prestanka uzimanja oralne antikoagulacijske terapije (OAT) najmanje dva tjedna.
Određivanje protrombotičkih rizičnih čimbenika treba učiniti uvijek kada ti rezultati utječu na terapijski protokol lije- čenja osnovne bolesti koja predstavlja poviš en rizik za trombozu (maligne i mijeloproliferativne bolesti, talasemija, sistemski lupus eritomatodes, antifosfolipidni sindrom, bolesti jetre, nefrotski sindrom, hiperlipidemija) ili kada treba profilaktič ki spriječiti novi trombotički događaj (moždani udar, TIA). Laboratorijski rezultati pomoći će kliničaru u određivanju vrste i trajanja antikoagulacijske terapije. Spoznaja o nasljednim čimbenicima rizika pomaže njihovim nosiocima u smislu profilaktičnog liječenja u kasnijim mogu- ćim stečenim stanjima povišenog rizika za trombozu (trauma, operacija, duga imobilizacija, trudnoća, kontracepcija, pretilost sa venskom stazom). Učestalost pojedinih protrombotičkih rizičnih čimbenika dosta se razlikuje s obzirom na ispitivanu populaciju prema etničkoj i regionalnoj pripadnosti, dobi i spolu pa su i literaturni podatci o tome prilično širokog raspona. Odluka o kriteriju kada i kome treba određivati protrombotič ke rizične čimbenike, nipošto se ne može se osnivati na njihovoj učestalosti u pojedinoj populaciji. Prvi neobjašnjeni trombotički događaj trebao bi biti kriterij za laboratorijsku dijagnostiku trombofilije koja bi se trebala proširiti na prvo koljeno u obitelji (majka, otac, brat, sestra) ako se utvrdi nasljedni poremećaj (1, 4).
KOJE PARAMETRE OBUHVAĆA LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA TROMBOFILIJA?
Laboratorijska dijagnostika protrombotič kog stanja ili laboratorijska dijagnoza trombofilije se osniva na ispitivanju prirodnih inhibitora zgrušavanja određivanjem funkcionalne aktivnosti AT, PC i PS te utvrđivanju disfibrinogenemije, antifosfolipidnih protutijela (APLA). Proširena laboratorijska ispitivanja uključuju određivanje rezistencije na aktivirani PC (APC rezistencija) uslijed mutacije u genu za čimbenik V (FV Leiden), protrombinemiju koja je povezana s mutacijom u genu za protrombin (FII 20210A), hiperhomocisteinemiju koja uključuje poremeć aje odgovarajućih metaboličkih putova zbog enzimskog i/ili vitaminskog nedostatka, određivanje FVIII te hiperlipidemiju. Ovim pokazateljima utvrđuju se nasljedna ili stečena stanja koja povećavaju rizik za vensku i rjeđe arterijsku trombozu te znače protrombotičke rizične čimbenike. Povezanost protrombotičkih rizičnih čimbenika i venske tromboze danas je dobro utvrđena posebice kod odraslih. Za razliku od toga, povezanost navedenih rizičnih čimbenika s arterijskom trombozom još se i sad pokušava utvrditi. Rezultati istraživanja kod odraslih ne mogu se preslikati na dječju dob, u prvom redu zbog fiziološke razlike u hemostazi, učestalosti tromboze i uključenosti pojedinih rizičnih čimbenika. Rezultati laboratorijskog ispitivanja dječje populacije trebaju se tumačiti s obzirom na raspon referentnih intervala primjerenih dobnim skupinama. Laboratorijsko određivanje navedenih parametara osniva se na testovima koji se izvode u plazmi ispitanika (fenotipizacija) ili analizi pojedinih mutacija iz izolirane DNA ispitanika (genotipizacija). Fenotipizacija je jednostavnija za izvođenje i potrebna joj je pristupačnija oprema, ali rezultati mogu biti različiti, a metode nestandardizirane. Genotipizacija je jasna i određena, ali nije dostupna svim laboratorijima. Stoga je potrebno kombinirati testove i napraviti razuman odabir testova i plan testiranja koji će zadovoljiti medicinsko i financijski opravdano stajalište. Svaka laboratorijska dijagnostika trombofilija obuhvaća određivanje globalnih testova koagulacije kao prve testove probiranja. Ovi testovi obuhvaćaju određivanje protrombinskog vremena (PV), aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (APTV), trombinskog vremena (TV) i fibrinogena.
PV – je osnovni test za utvrđivanje poremeć aja vanjskog puta zgrušavanja kojim je obuhvaćena aktivnost čimbenika VII, te aktivnosti čimbenika zajedničkog puta zgrušavanja (X, V, II, I tj. fibrinogen). Snižena aktivnost jednog ili više čimbenika rezultira produženjem vremena zgrušavanja. Izražava se kao postotak od normalne plazme. APTV – je globalni test za brzo utvr- đivanje poremećaja unutarnjeg i zajednič kog puta zgrušavanja. Osjetljiv je na čimbenike XII, XI, X, IX, VIII, V, II i I, a nije osjetljiv na čimbenike VII i XIII. U pravilu je produženo ako je aktivnost ovih čimbenika < 30% ili ako u plazmi postoje specifična protutijela na pojedini čimbenik. Također se može upotrijebiti kao test probiranja za lupus antikoagulant (LA), ukoliko je reagens osjetljiv na LA. TV - je brzi test probiranja koji upu- ćuje na razinu fibrinogena, prisutnost razgradnih produkata fibrinogena i fibrina ili heparina u plazmi.
Određivanje koncentracije fibrinogena u citratnoj plazmi temelji se na turbidimetrijskoj metodi određivanja završne točke zgrušavanja. Literatura navodi disfibrinogenemiju i hipofibrinogenemiju kao vrlo rijetke ali moguće rizične čimbenike za nastanak tromboze (učestalost nasljedne disfibrinogenemije u bolesnika s trombozom je 0,8–1,0%). Više je podataka iz literature o povišenim vrijednostima fibrinogena odgovornim za hiperkoagulabilna stanja a time i kao moguć protrombotički čimbenik rizika.
Specifični testovi obuhvaćaju određivanje: AT AT je protein plazme s višestrukim inhibicijskim djelovanjem unutar sustava zgrušavanja, posebice trombina. Opisano je više od 250 mutacija u genu za AT. Nasljedni nedostatk AT je vrlo rijetka pojava. Učestalost iznosi 0,05 – 1,0% u općoj populaciji, 1% kod bolesnika s utvrđenom venskom trombozom, a 4% kod nasljedne trombofilije (6). Nasljedni nedostatak povezan je s venskom i rjeđe s arterijskom trombozom. U heterozigota je 5-20 puta veći rizik za nastanak tromboze (7). Određivanje funkcionalne aktivnosti AT-a fotometrijskom metodom uz uporabu kromogenog supstrata u citratnoj plazmi prva je razina ispitivanja njegovog nedostatka. Određuje se rutinski i moguće ga je odrediti u svim koagulacijskim laboratorijima. Izražava se kao postotak aktivnosti u odnosu na normalnu plazmu. Referentni interval iznosi 75–125% za odrasle, a 43,4 – 70,8 % za novorođenčad (8). Snižene aktivnosti mogu se naći u akutnoj trombozi, nakon operacije, DIK-u, bolestima jetre, nefrotskom sindromu, heparinskoj terapiji ili terapiji L-asparginazom i kod uzimanja oralnih kontraceptiva. Potvrđ ivanje nedostatka AT uključuje drugu razinu ispitivanja određivanjem koncentracije antigene determinante AT te funkcionalnih testova progresivne inhibicijske aktivnosti ili kofaktorske heparinske aktivnosti (1, 9, 10). PC PC je o vitaminu K ovisan glikoprotein koji se sintetizira u jetri i ima važnu ulogu u regulaciji stvaranja trombina. Aktivira ga kompleks trombin-trombomodulin te uz PS kao kočimbenik djeluje antikoagulacijski, inaktivirajući FVa i FVIIIa. Također stimulira i fibrinolitički sustav. Razlikujemo dva tipa nedostatka: tip I – kvantitativni nedostatak kojeg karakterizira smanjena aktivnost i koncentracija antigena i tip II – kvalitativni nedostatak kada nalazimo sniženu funkcionalnu aktivnost dok je koncentracija antigena normalna. Opisana je 161 mutacija u genu za PC (11). U homozigota se opisuju opetovani trombotički događaji. U heterozigota za nedostatak PC 7-10 puta je povećan rizik za nastanak DVT. Učestalost nasljednog nedostatka PC u trombofilič nih bolesnika je 4,8%, a 0,2 –0,4% u općoj populaciji (11). Stečeni nedostatak nalazimo u bolestima jetre, DIK-u, nedostatku vitamina K i OAT (1, 5, 12). Određivanje aktivnosti PC u uzorcima plazme je standardan mjerni postupak pomoć u kromogenog supstrata koji se izra- žava kao postotak aktivnosti u odnosu na normalnu plazmu. Referentni interval uvelike ovisi o dobi (8, 13). Potvrđivanje nedostatka PC vrši se u drugoj razini ispitivanja određivanjem koncentracije antigena (3, 5). PS PS je o vitaminu K ovisan glikoprotein, koji djeluje kao neenzimski kočimbenik APC-a. Sintetizira se u jetrenim stanicama i endotelnim stanicama krvnih žila. U plazmi se PS nalazi u dva oblika, 40% kao slobodni i 60% u nekovalentnom kompleksu s C4b-veznim proteinom (C4bBP). Samo slobodni PS je funkcionalno aktivan. Koncentracija PS u plazmi ovisi o fiziološ kom stanju, ali i o kliničkom stanju ispitanika. Dokazano je da na koncentraciju PS utječu spolni hormoni, posebice estrogen, stoga žene u premenopauzi imaju niže koncentracije u odnosu na mu- škarce i žene u postmenopauzi. Trudnice i žene koje koriste oralne kontraceptive takođ er imaju niže koncentracije PS. Očekivano niže vrijednosti su kod novoro- đenčadi. Za razliku od toga, koncentracija PS se povećava sa starosnom dobi. Snižene koncentracije PS nalazimo u bolesnika na OAT i kod bolesnika s bolestima jetre. Povišene ili snižene koncentracije PS imaju bolesnici sa šećernom bolesti dok nema promjene kod bolesnika s DIK-om. U reakciji akutne faze C4bBP se sintetizira u povećanoj mjeri, uslijed čega nalazimo snižene koncentracije slobodnog PS. Ovaj slučaj najčešće je opa- žen neposredno nakon DVT. Poznata su tri tipa nasljednog nedostatka PS: tip I – karakterizira snižena funkcionalna aktivnost PS i koncentracije ukupnog i slobodnog PS antigena, tip IIkarakterizira snižena funkcionalna aktivnost PS uz normalne koncentracije ukupnog i slobodnog PS antigena, tip III – karakterizira snižena funkcionalna aktivnost PS i koncentracije slobodnog PS antigena dok je koncentracija ukupnog PS antigena normalna. Najučestaliji nedostatak PS je tip I ili tip I/III (14). Opisana je 131 mutacija gena za PS (11). U heterozigota je 6-10 puta povećan rizik za nastanak venske tromboze. Učestalost heterozigota regionalno se dosta razlikuje, ali se može reći da bolesnici s DVT pokazuju učestalost od 1-2%, a 6% u obiteljima s trombofilijama (6). Učestalost nalaza snižene koncentracije slobod- 97 J. Leniček Krleža. Laboratorijska dijagnostika trombofilije. Paediatr Croat 2005;49:95-100 nog PS antigena u normalnoj populaciji kreće se od 0,03–0,13% (10, 15, 16). Kako je u plazmi fiziološki aktivan samo slobodni PS, a funkcionalni testovi su slabo specifični, metoda izbora u određ ivanju nedostatka PS je određivanje samo koncentracije antigena slobodnog PS imunokemijskom metodom koja naj- češće prethodno uključuje taloženje vezanog PS (5).
Koncentracija antigena slobodnog PS izražava se kao postotak u odnosu na normalnu plazmu. Referentni interval uvelike ovisi o dobi i za tumačenje nalaza i dijagnozu nedostatka PS potrebno ga je dobro definirati prema dobnim skupinama (8, 16, 17).
DISFIBRINOGENEMIJA
Određivanje koncentracije fibrinogena, TV-a i vrijeme reptilaze jednostavni su testovi za utvrđivanje rijetkih slučajeva disfibrinogenemije udruženih s povećanim rizikom za trombozu. Potvrđuje se usporednim određivanjem funkcionalnog fibrinogena koji je u pravilu snižen i imunoreaktivnog fibrinogena koji je nepromjenjen ili čak povišen (3, 5). APC i FV LEIDEN APC rezistencija je najučestaliji uzrok venske tromboze. U 95% slučajeva je posljedica točkaste mutacije gena za FV (FV Leiden) koja nastaje zbog zamjena gvanina s adeninom na poziciji 1691. Uslijed toga se smanjuje antikoagulacijska aktivnost APC-a zbog usporenog inaktiviranja FV pa se povećava prokoagulacijska aktivnost kao i rizik za nastajanje ugruška. Opisana su stanja stečene APC rezistencije: trudnoća, primjena oralnih kontraceptiva, povišena koncentracija FVIII, LA, akutni moždani udar itd. (6). Učestalost ove mutacije regionalno je vrlo različita i kreće se od 0-15%. U heterozigota je 7 puta veći rizik, a u homozigota 80 puta veći rizik za nastanak venske tromboze (18). Učestalost mutacije iznosi 40% u bolesnika s venskom trombozom. Uporaba oralnih kontraceptiva i hormonska nadomjesna terapija kod žena s FV Leidenom povećavaju rizik za trombozu 20-30 puta (19). Određivanje APC rezistencije ne može se koristiti za utvrđivanje mutacije, ali se može koristiti kao test probiranja. Utvr- đivanje FV Leidena vrši se DNA analizom, načešće metodom lančane reakcije polimerazom (PCR-analiza)(20). FII 20210A Mutacija gena za FII G20210A (21) nastaje uslijed zamjene gvanina s adeninom na poziciji 20210 3’- UT regije. Ova mutacija je povezana s povećanom koncentracijom protrombina što izravno povećava rizik za trombozu. Nije poznat mehanizam povećanja protrombina na osnovu ove mutacije. Povezan je sa povećanim rizikom DVT i moždanim udarom. Učestalost ove mutacije kod neselektiranih bolesnika s trombozom iznosi 7%, a kod bolesnika sa suspektnom nasljednom trombofilijom 16% (11). Heterozigoti pokazuju 2-3 puta povećen rizik za nastanak venske tromboze. Interakcija sa oralnim kontraceptivima kod žena s mutacijom povećava rizik za trombozu 16 puta u odnosu na žene koje nemaju mutaciju (10, 19). Utvrđivanje mutacije FII 20210A vrši se isključivo DNA analizom, metodom PCR-a (21, 22). HIPERHOMOCISTEINEMIJA Homocistein (Hcy) je utvrđen neovisan rizični čimbenik za nastanak ateroskleroze krvnih žila srca i mozga te tromboemboliju arterija i vena. Povišene vrijednosti Hcy i njegov višestruki utjecaj na hiperkoagulabilno stanje dobro su utvr- đeni u odraslih ali i u djece u različitim bolesnim stanjima (23). Za nastanak blage hiperhomocisteinemije najčešće su odgovorni manjak folne kiseline i vitamina B12, zbog nedovoljnog unosa, te genetski poremećaji u sintezi enzima 5,10-metilentetrahidrofolat reduktaze (MTHFR), cistationin _-sintaze (CBS) ili metionin sintaze (MS). Za određivanje homocisteina u plazmi, te vitaminskog statusa i folne kiseline u serumu koriste se imunokemijske metode kao metode izbora (5, 24). Prva razina ispitivanja obuhvaća odre- đivanje koncentracije Hcy standardiziranom metodom visokotlačne tekućinske kromatografije (HPLC) ili jednom od metoda izbora: enzimi-imunokemijskim testovima (EIA) ili fluoroescentnim polarizacijskim imunokemijskim testovima (FPIA), uz standardizirane uvjete uzimanja uzorka i primjene referentnih intervala prema dobi i spolu. U slučaju povišenih vrijednosti Hcy, druga razina laboratorijskog dijagnosticiranja uključuje određivanje vitaminskog statusa (B12, rjeđe B6) i folne kiseline kao najčešćih uzroka stečene blage hiperhomocisteinemije. Na ovoj razini, Hcy se može korigirati na razinu normalnih vrijednosti uvo- đenjem terapije vitaminom B12 i folnom kiselinom. Opetovano određivanje Hcy treba učiniti nakon terapije ili prekidom terapije od najmanje dva tjedna. Povišene vrijednosti Hcy i normalne vrijednosti vitamina i folne kiseline upućuju na nasljedni poremećaj vezan za metabolizam Hcy. Najučestaliji nasljedni poremećaj u metabolizmu Hcy koji rezultira blagom hiperhomocisteinemijom je točkasta mutacija C677T gena za enzim MTHFR. Supstitucija baze citozina u timin dovodi do termolabilnosti i smanjene enzimske aktivnosti. Mutacija C677T MTHFR kod homozigota smanjuje njegovu aktivnost za 70%, a kod heterozigota za 30%. Ovaj poremeć aj povezan je s povećanim rizikom za arterijsku bolest srca, moždani udar i ishemijsku osteonekrozu. Nadomjesna terapija folnom kiselinom može smanjiti učinak ove mutacije na koncentraciju Hcy (5, 25).
Za utvrđivanje mutacije C677T MTHFR gena koristi se DNA analiza i to najčešće metoda lančane reakcije polimerazom (PCR-analiza)(26). FVIII Povišena vrijednost FVIII predstavlja rizični čimbenik za nastanak venske tromboze. Učestalost povišenih vrijednosti FVIII u bolesnika s venskom trombozom iznosi 19-25% (27). U ovim slučajevima povišene vrijednosti FVIII nisu povezane s reakcijom akutne faze već ostaju trajno povišene. Funkcionalna aktivnost FVIII se odre- đuje najčešće koagulometrijskom metodom uporabom FVIII deficijentne plazme, a može se određivati i kromogenom metodom.
ANTIFOSFOLIPIDNA PROTUTIJELA (APA)
APA obuhvaćaju skupinu autoprotutijela koja izravno mijenjaju naboj fosfolipida ili fosfolipid-protein kompleksa. Također, reagiraju s ostalim plazmatskim proteinima uključenim u hemostazu, trombocitima i endotelnim stanicama krvnih žila. Klinički važna APA uklju- čuju LA i antikardiolipinska protutijela (aCA)(28), a povezuju se s arterijskom i venskom trombozom, osteonekrozom i arterijskom bolesti srca (10). Zbog heterogenosti, LA je nemoguće utvrditi pomoću samo jednog koagulacijskog testa ovisnog o fosfolipidima. Utvr- đivanje prisutnosti LA izvodi se prema preporukama Znanstvenog odbora za standardizaciju LA i antifosfolipidnih protutijela Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu (ISTH). Prema ovim preporukama prva faza se provodi uporabom najmanje dva različita testa probiranja ovisnih o fosfolipidima. Ukoliko je jedan ili više testova produž eno, potrebno je pomiješati ispitivanu plazmu s normalnom plazmom u omjeru 1:1 te ponoviti određivanje testa koji je produžen. U slučaju kad ne dolazi do korekcije rezultata nakon miješanja s normalnom plazmom potrebno je dokazati prisutnost LA potvrdnim testom koji uključ uje dodatak fosfolipida (29). aCA se određuju ELISA metodom i to najčešće klase IgG i IgM, dok se protutijela klase IgA ne smatraju klinički važnim (10). Rezultati se izražavaju kao koncentracije protutijela ili kao pozitivne/ negativne vrijednosti na osnovu ”cut off” vrijednosti od 12 U/mL.
HIPERLIPIDEMIJA
U opsežnim studijama povišene vrijednosti lipida i lipoproteina su potvrđeni rizični čimbenici za nastanak ateroskleroze i tromboze, a time i za nastanak kardiovaskularne i cerebrovaskularne bolesti. Prema literaturnim podacima najznačajniji neovisni čimbenici rizika su lipoprotein (a) _Lp(a)_ i LDL frakcija kolesterola (1). Određuju se rutinskim analizama na prvoj razini laboratorijskog istraživanja trombofilija.
PLAN LABORATORIJSKE DIJAGNOSTIKE TROMBOFILIJA
Kako do danas ne postoji niti jedan pouzdani globalni test za probiranje trombofilič nih bolesnika potrebno je učiniti mnogo testova koji nisu jednostavni i dosta su skupi. Zbog toga je neophodno napraviti plan laboratorijske dijagnostike i pažljivo odabrati ispitanike. Kriterij za laboratorijsku dijagnostiku trombofilija trebao bi biti prvi trombotič ki događaj. Cilj je ustanoviti uzrok poremeć aja u svrhu terapije i preventivnog liječenja od slijedećeg trombotičkog događ aja (5). Prvenstveno je potrebno isključiti ste- čene uzroke trombofilije (sistemski lupus eritematodes, antifosfolipidni sindrom, maligne, mijeloproliferativne bolesti, vaskulitis). Osim rutinskih biokemijskih i hematoloških analiza (lipidogram, Lp(a), CRP, KKS) potrebno je učiniti i globalne testove koagulacije koji brzim i jednostavnim određivanjem daju uvid u sva područ ja sustava zgrušavanja te određivanje LA i/ili aCA IgG i IgM klase imunoglobulina. Nakon isključivanja stečenih trombofilija, slijedi utvrđivanje rizičnih čimbenika nasljedne trombofilije koje se provodi uporabom specifičnih testova na dvije razine. Prva razina – koriste se testovi za isključ ivanje ili potvrđivanje najčešćih uzroka nasljednih trombofilija. Ovi testovi uključuju određivanje funkcionalne aktivnost prirodnih antikoagulansa AT i PC, koncentracije slobodnog PS antigena, APC rezistencije pomoću FV deficijentne plazme te koncentracije homocisteina. Dijagnoza nedostatka prirodnih antikoagulansa PC, PS te APC rezistencija otežana je u bolesnika na OAT te se ovi testovi preporučuju učiniti nakon prestanka uzimanja OAT ili je potrebno zamjeniti OAT 10 dana s niskomolekularnim heparinom. U slučaju da se rezultati nalaze izvan referentnog intervala prema dobi i spolu bolesnika potrebno je daljnje ispitivanje specifičnim testovima druge razine. Ako su rezultati testova prve razine unutar granica normalnih vrijednosti, a utvrđeno je postojanje obiteljske ili osobne tromboze, pristupa se ispitivanju disfibrinogenemije (TV i fibrinogen). Druga razina – obuhvaća specifične testove koji se izvode na molekularnoj razini za utvrđivanje mutacija (FV Leiden, FII 20210A, MTHFR C677T), određivanje aktivnosti FVIII te koncentracije vitamina B12 i folne kiseline.
ZAKLJUČAK
Protrombotički rizični čimbenici mogu se povezati s mnogim trombofiličnim stanjima. Ova stanja moguće je utvrditi pomoć u relativno jednostavnih laboratorijskih metoda iako ne dovoljno jeftinih za određivanje cjelokupne neselektirane populacije. Pažljivim odabirom bolesnika, vremenom određivanja kao i dobrim plani- ranjem testova znatno se smanjuje generalizirana cijena laboratorijske dijagnostike trombofilija, a utvrđivanje nasljednih poremeć aja i mogućnost preventivne terapije u daljnjem životu bolesnika zasigurno je financijski opravdana. Zahvala: Zahvalila bih mentorici doc. dr. Renati Zadro, voditeljici Zavoda za hematologiju i koagulaciju Kliničkog zavoda za laboratorijsku dijagnostiku KBC Zagreb, te dipl. ing. med. biokemije Desire Coen Herak na pomoći pri izradi radnje i razumijevanju problematike.
LITERATURA
1. Vaishnav A. Blood Dyscrasias and Stroke. Book of American Academy of Neurology and American Heart Association. www/emedicine/com
2. Coull BM, Beamer N, de Garmo P, Sexton G, Nordt F, Knox R, Seaman GVF. Chronic blood hyperviscosity in subjects with acute stroke, transient ischemic attack, and risk for stroke. Stroke 1991;22: 162-168.
3. Coen D. Laboratorijska dijagnostika trombofilije. Priručnik tečaja trajne izobrazbe. Laboratorijska dijagnostika poremećaja zgrušavanja. 1997:19-24.
4. Chan AK, de Veber G. Prothrombotic disorders and ischemic stroke in children. Semin Pediatr Neurol 2000;7(4):301-8.
5. Tripodi A, Mannucci PM. Laboratory investigation of thrombophilia. Clin Chem 2001;47:1597-606. 6. Bertina RM. Molecular risk factors for thrombosis. Thromb Haemost 1999; 82: 601-9.
7. Triplett DA. Antithrombin deficiency. In: Goodnight S.H, Hathaway WE. Disorders of Hemostasis and Thrombosis, New York; McGraw-Hill, 2001a; 359-65.
8. Stanojević M, Koprčina B. Smetnje koagulacije u novorođenačkoj dobi. Paediatr Croat 2004;48(suppl1): 73-88.
9. Hirsh J, Dalen JE, Guyatt G. A glossary of Clinical Risk Factors.The Sixth (2000) ACCP guidelines for antithrombotic therapy for prevention and treatment of thrombosis. Chest 2001;119:1S-2S.
10. V. Karttunen Patent foramen ovale and cryptogenic brain infarction Reviewed by S. Juvela, K. Murros URL: http://herkules.oulu.fi/isbn9514267435, Printed format Acta Univ. Oul., 2002; D 684
11. Seligsohn U, Lubetsky A. Genetic susceptibility to venous thrombosis. N Engl J Med 2001;344: 1222-31.
12. Taylor M etc. Genetic considerations in thrombotic disorders. Genetic Drift 2002;20:1-17.
13. Guideline:The investigation and menagment of neonatal haemostasis and thrombosis. Br J Haematol 2002; 119:295-309
14. Triplett DA: Protein S deficiency. In: Goodnight SH Jr & Hathaway WE (eds) Disorders of Hemostasis and Thrombosis. New York: McGraw-Hill, 2001b;374-80.
15. Dykes AC, Walker ID, McMahon AD, Islam SIAM, Tait C. A study of protein S antigen levels in 3788 healthy volunteers: influence of age, sex, and hormone use, and estimate for prevalence of deficiency state. Br J Haematol 2001;113:636-641.
16. Carraro P: Guidlenes for the laboratory investigation of inherited thrombophilias. Recommendations for first level clinical laboratories. European Community Confederation of Clinical Chemistry (EC4) Working Group on Guidelines for Investigating Disease. Clin Chem Lab Med 2003;41: 382-91.
17. Sthoeger D, Nardi M, Karpatkin M. Protein S in the first year of life. Br J Haematol 1989; 72:424-8.
18. Koster T, Rosendaal FR, de Ronde H, Briët E, Vandenbroucke JP, Bertina R. Venous thrombosis due to poor anticoagulant response to activated protein C: Leiden thrombophilia study. Lancet 1993; 342:1503-6.
19. Rosendaal FR, Helmerhorst FM, Vandenbroucke JP. Oral contraceptives, hormone replacement therapy and thrombosis.Thromb Haemost 2001;86:112-23.
20. Zoller B, Svensson PJ, He X, Dahlback B. Identification of the same factor V gene mutation in 47 out of 50 thrombosis-prone families with inherited resistance to activated protein C. J Clin Invest 1994; 94(6):2521-4.
21. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3'-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996;88: 3698-703.
22. Coen D, Zadro R, Honovic L, Banfic Lj, Stavljenic Rukavina A. Prevalence and association of the factor V Leiden and prothrombin G20210A in healthy subjects and patients with venous thromboembolism. Croat Med J 2001;42:488-92.
23. De Stefano V, Finazzi G, Mannucci PM. Inherited thrombophilia: pathogenesis, clinical syndromes and management. Blood 1996;87:3531-44.
24. Tripodi A, Chantarangkul V, Lombardi R, Lecchi A, Mannucci PM, Cattaneo M. Multicenter study of homocysteine measurement. Performance characteristics of different methods, influence of standards on interlaboratory agreement of results. Thromb Haemost 2001;85:291-95.
25. Anonimno. Brief Overview of Coagulation Disorders in Osteonecrosis. http://maxillofacialcenter.com
26. Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJH, den Heijer M, Kluijtmans LAJ, van den Heuvel LP, Rozen R. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylentetrahydrofolate reductase. Nature Genetics 1995; 10: 111-3.
27. Kraaijenhagen RA, Anker PS, Koopman MM, Reitsma PH, Prins MH, van der Ende A, Büller HR. High plasma concentration of of FVIIIc is a major risk factor for venous thromboembolism. Thromb Haemost 2000;83:5-9.
28. Greaves M. Antiphospholipid antibodies and thrombosis. Lancet 1999;353:1348-53.
29. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulant/ Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the ISTH. Thromb Haemost 1995;74:1185-90.