Promjene u limfocitnom fenotipu novorođenčadi s infekcijom

Novoro|en~ad, a posebno nedono{~ad, ~e{}e obolijeva od zaraznih bolesti zbog nepotpuno razvijenog imunosustava. Da bi se istra`ile posebnosti limfocitnog fenotipa novoro|en~adi s ranim znakovima perinatalne infekcije, odre|ene su njihove limfocitne populacije i uspore|ene s nalazima u zdrave djece. Limfociti iz umbilikalne krvi 14-ero novoro|en~adi sa simptomima infekcije i 52-je zdrave novoro|en~adi analizirani su na proto~nom citometru nakon dvostrukog bojenja monoklonskim protutijelima. Da bi se isklju~io utjecaj razli~ite gestacije na limfocitni fenotip, istra`ivan je u~inak infekcije posebno za nedono{~ad do 32 tjedna gestacije i nedono{~ad od 32 do 37 tjedana, jer su sa simptomima infekcije bila samo nedono{~ad.
Postotak je limfocita T, pomaga~kih i citotoksi~nih limfocita T bio vjerodostojno ni`i u skupini novoro|en~adi s infekcijom, dok je udio neobojenih stanica bio znatno vi{i u toj skupini. Udio se stanica CD45R0+CD4+ nije pove}ao u novoro|en~adi s infekcijom, nego je u obje skupine bio podjednako nizak (1,1 i 1%).
Sli~ni su rezultati za nedono{~ad do 32 tjedna gestacije, samo nije bilo pouzdane razlike u postotku pomaga~kih limfocita T izme|u bolesne i zdrave djece. Za nedono{~ad od 32 do 37 tjedana gestacije nisu utvr|ene vjerodostojne razlike, ali su uo~ljive iste tendencije.
Novorođenčad, a posebno nedonoščad, češće obolijeva od zaraznih bolesti zbog nepotpuno razvijenog imunosustava. Da bi se istražile posebnosti limfocitnog fenotipa novorođenčadi s ranim znakovima perinatalne infekcije, određene su njihove limfocitne populacije i uspoređene s nalazima u zdrave djece. Limfociti iz umbilikalne krvi 14-ero novorođenčadi sa simptomima infekcije i 52-je zdrave novorođenčadi analizirani su na protočnom citometru nakon dvostrukog bojenja monoklonskim protutijelima. Da bi se isključio utjecaj različite gestacije na limfocitni fenotip, istraživan je učinak infekcije posebno za nedonoščad do 32 tjedna gestacije i nedonoščad od 32 do 37 tjedana, jer su sa simptomima infekcije bila samo nedonoščad.
Postotak je limfocita T, pomagačkih i citotoksičnih limfocita T bio vjerodostojno niži u skupini novorođenčadi s infekcijom, dok je udio neobojenih stanica bio znatno viši u toj skupini. Udio se stanica CD45R0+CD4+ nije povećao u novorođenčadi s infekcijom, nego je u obje skupine bio podjednako nizak (1,1 i 1%).
Slični su rezultati za nedonoščad do 32 tjedna gestacije, samo nije bilo pouzdane razlike u postotku pomagačkih limfocita T između bolesne i zdrave djece. Za nedonoščad od 32 do 37 tjedana gestacije nisu utvrđene vjerodostojne razlike, ali su uočljive iste tendencije.
Veća zastupljenost dvostruko negativnih limfocita rezultat je smanjene ekspresije membranskih molekula i označava nezreliji i manje djelotvoran imunosustavu u novorođenčadi s infekcijom. Stanice CD45R0+CD4+ ne mogu se iskoristiti kao marker infekcije u novorođenčadi.
UVOD Novorođenački imunosustav, u odnosu na odrasli, obilježavaju kvantitativne i kvalitativne razlike koje ga čine nedovoljno kompetentnim. Osim što mnogi dijelovi tog sustava još nisu potpuno razvijeni, oni su i bez iskustva, jer u zaštićenoj intrauterinoj sredini nisu morali reagirati na strane antigene. Zbog neadekvatne je imunoreakcije novorođenčad podložnija infekcijama, i to znatnije ako je gestacija kraće trajala. Transplacentarno prenesena majčina protutijela i postnatalno ona iz majčina mlijeka predstavljaju pasivnu imunost koja pomaže novorođenčetu da se obrani od mnoštva mikroorganizama kojima je naglo izloženo prelaskom u ekstrauterini svijet. Ipak, već prema analizama uzroka morbiditeta i mortaliteta, može se zaključiti da u novorođenčadi postoji prolazna razvojna imunodeficijencija, koja se nastavlja i u kasnije dojenačko razdoblje (1, 2, 3 ,4).
Incidencija sepse u novorođenčadi otprilike je 2-3 na tisuću, a u nedonoščadi je višestruko veća nego u donošene novorođenčadi. To povećanje u skupini djece ekstremno niske porođajne težine iznosi i 50-100 puta. Na djecu vrlo niske porođajne težine otpada daleko najveći broj hospitalnih infekcija koje se u jedinicama intenzivne neonatalne skrbi javljaju u 20-25% djece. Smrtnost od infekcija u novorođenčadi je i dalje visoka (10-50% od početka primjene antibiotika), unatoč znatnom napretku medicine zadnjih desetljeća (5, 6, 7).
Tako visoki morbiditet i mortalitet od infekcija posljedica je neadekvatne prirođene i stečene imunosti novorođenčadi. Kontrolu nad infekcijom konačno uspostavljaju aktivirani specifični limfociti. Nezrelost limfocita novorođenčadi, nepostojanje memorijskih pomagačkih T-limfocita i slaba koordinacija s drugim elementima imunosustava glavni su razlozi neotpornosti prema infekcijama (1, 8, 9).
Određivanje limfocitnog fenotipa važan je dio ispitivanja imunostatusa. Membranske molekule koje karakteriziraju pojedine subpopulacije limfocita mogu biti u različitoj mjeri izražene, ovisno o stupnju zrelosti i aktivaciji stanica. Valja očekivati da se postojanje infekcije odrazi i u različitoj zastupljenosti limfocitnih subpopulacija.
CILJ
Cilj je ovog istraživanja ispitati razlike limfocitnog fenotipa novorođenčadi s ranim znakovima perinatalne infekcije u odnosu na limfocitni fenotip zdrave novorođenčadi. Kako su simptome infekcije u prva 2 dana života imala pretežno nezrelija nedonoščad, čiji imunofenotip karakteriziraju mnoge posebnosti već zbog veće nezrelosti, to se utjecaj infekcije analizirao posebno u dvije skupine nedonoščadi različite gestacijske zrelosti. Tako se pokušao umanjiti utjecaj nezrelosti na zastupljenost limfocitnih populacija, a jasnije istaknuti imunoodgovor novorođenčadi određene gestacijske dobi na infekciju.
Pouzdano utvrđene razlike u limfocitnom fenotipu mogle bi koristiti kao dodatni pokazatelj postojanja perinatalne infekcije, koju je često teško odmah nakon rođenja sa sigurnošću dijagnosticirati. Promjenama u zastupljenosti limfocitnih subpopulacija mogli bi se također pokušati objasniti imunosni razlozi obolijevanja od zaraznih bolesti, ali isto tako bi se te promjene mogle tumačiti kao posljedica imunoreakcije na infekciju.
MATERIJAL I METODE
Analizirana je umbilikalna krv nasumce odabrane 66-ero novorođenčadi, rođene u Klinici za ženske bolesti i porode KBC-a Zagreb, 1993. i 1994. godine. Vaginalnim putem je porođeno njih 57, a carskim rezom 9, bilo je 28 djevojčica i 38 dječaka, a 14-ero je novorođenčadi bilo hipotrofično. Nije bilo razlika u limfocitnom fenotipu s obzirom na spol, uhranjenost novorođenčadi ili način završetka trudnoće. Prema gestacijskoj zrelosti novorođenčad je razvrstana u 3 skupine. Bilo je 10-ero nedonoščadi gestacije od 24 do 32 tjedna, 35-ero nedonoščadi gestacije od 32 do 37 tjedana i 21 terminsko novorođenče. Ukupno je 14-ero novorođenčadi imalo dijagnozu perinatalne infekcije, postavljenu prema tijeku trudnoće i poroda, kliničkoj slici, hematološkim, biokemijskim, mikrobiološkim i patohistološkim parametrima. Od tih je 14-ero novorođenčadi sa simptomima i nalazima koji su u prva 2 dana po rođenju upućivali na infekciju, njih 6 bilo gestacije ispod 32 tjedna, a 8 ih je bilo u skupini zrelije nedonoščadi, dok su sva donošena novorođenčad bila zdrava. Svi su uzorci krvi u hepariniziranim epruvetama pohranjeni na +4 oC do obrade koja je uslijedila unutar 12 sati od rođenja i vađenja krvi.
Mononuklearne su stanice izdvojene iz krvi separacijom na otopini fikola i nakon ispiranja njihova se suspenzija razdijelila u više malih epruveta, kao što je opisano (10). Slijedilo je obilježavanje stanica dodatkom pojedine kombinacije dvaju monoklonskih protutijela u svaku od epruveta. Rabljena su komercijalna monoklonska protutijela, izravno obilježena fluorokromima: jedno fluorescein-izotiocijanatom (FITC) i drugo fikoeritrinom (PE). Nakon inkubacije, ispiranja i resuspenzije, stanice su analizirane na protočnom citometru. Prvo su se u analiziranom uzorku limfociti definirali postupkom ograđivanja na temelju veličine i zrnatosti stanica, a ispravnost se ograđivanja provjerila kombinacijom monoklonskih protutijela CD45/CD14. Zatim su se odredile limfocitne subpopulacije prema fluorescenciji na dvoparametrijskim histogramima koju su davali limfociti obilježeni istodobno s dva monoklonska protutijela. U svakom se uzorku analiziralo najmanje 10 000 stanica, a rezultati su izraženi kao postoci stanica koje je obilježavalo jedno ili drugo protutijelo, zatim oba protutijela ili nijedno od njih, što je onda značilo da te stanice na svojoj membrani ne nose antigene na koje se vežu dodana protutijela. Konačno je zbroj postotaka stanica po kvadrantima na histogramima, čija koordinatna os x prikazuje intenzitet jedne, a y druge fluorescencije, bio uvijek 100.
Za fenotipsku su analizu upotrijebljena sljedeća protutijela iz palete Simultest Reagents tvrtke Becton Dickinson (San Jose, CA, SAD): CD3-FITC/CD16+CD 56-PE, CD3-FITC/CD19-PE, CD3FITC/ /Anti-HLA-DR-PE i CD4-FITC/CD8-PE, a iz palete Dako Dual Colour Reagents tvrtke Dako A/S (Glostrup, Danska) upotrijebljena je kombinacija CD45R0-FITC /CD4-PE. Analize su učinjene na protočnom citometru FACScan tvrtke Becton Dickinson (San Jose, CA, SAD).
Rezultati su prikazani na tablicama medijanom i rasponom postotaka obilježenih ili neobilježenih limfocita od ukupnih limfocita, a razlika je ispitana neparametrijskim Mann-Whitneyevim testom. Vrijednosti p<0,05 smatrane su signifikantnima i na tablicama su istaknute.
REZULTATI
Na tablici 1 prikazani su rezultati ispitivanja limfocitnog fenotipa u 14-ero novorođenčadi sa znacima infekcije i 52-je zdrave novorođenčadi, iz svih gestacijskih skupina. Uočavaju se brojne, statistički pouzdane razlike u zastupljenosti ispitivanih biljega na limfocitima bolesne i zdrave djece. Kombinacijom protutijela za antigene CD3 i CD16, CD56 određen je postotak T-limfocita i NK-stanica. Stanice CD3+- CD16-CD56- predstavljaju limfocite T i njihov je postotak u skupini novorođenčadi sa znakovima infekcije signifikantno snižen. Udio stanica CD3-CD16+CD56+, koje su NK-stanice, među limfocitima se nije razlikovao u obje skupine novorođenčadi, isto kao ni udio stanica CD3+- CD16+CD56+, koje su citotoksični T-limfociti s NK-biljegom, a prepoznaju antigene bez molekula glavnog kompleksa tkivne snošljivosti. Zastupljenost limfocita bez ovih biljega na membrani, a to su limfociti B zajedno s nezrelim formama limfocita, bila je znatno veća u skupini bolesne novorođenčadi. Postotak je T-limfocita ili CD3+-stanica određivan i primjenom drugih dviju kombinacija monoklonskih protutijela i ponovno je bio signifikantno niži u skupini novorođenčadi sa simptomima infekcije. Stanice CD3+HLA-DR+ su aktivirani T-limfociti, s izraženim membranskim molekulama 2. razreda glavnog kompleksa tkivne snošljivosti, koji su podjednako zastupljeni u analiziranim skupinama. Jednak je u obje skupine i postotak B-limfocita ili stanica CD3-HLA-DR+, odnosno CD3-CD19+, ali je fenotip CD3-- HLA-DR+ zastupljeniji u odnosu na drugi B-limfocitni fenotip, posebno u skupini bolesne novorođenčadi, jer uključuje vrlo vjerojatno i nezrele (CD34+) limfocite i aktivirane NK-stanice (11, 12). U skupini bolesnih je ponovno znatno više neobilježenih stanica, koje uz NK-stanice obuhvaćaju i nezrele limfocite.
Primjenom protutijela za biljege CD4 i CD8 određen je postotak pomagačkih (CD4+CD8-) i citotoksičnih (CD4-CD8+) T-limfocita. Fenotip CD4-CD8+ uključuje i manju subpopulaciju NK-stanica. U skupini novorođenčadi sa znakovima infekcije bilo je znatno manje i pomagačkih i citotoksičnih limfocita T, a znatno više limfocita bez tih biljega na membrani, koji mogu biti limfociti B, NK-stanice gd-limfociti T i nezreli oblici.
Iz tablice 1. je nadalje vidljivo da je zastupljenost izoforme zajedničkoga leukocitnog antigena CD45R0 vrlo niska na T-limfocitima novorođenčadi obiju skupina. Smatra se da aktivirani i memorijski T-limfociti, koji su važni za brzo pokretanje specifičnih imunoreakcija, imaju tu izoformu na membrani, za razliku od naivnih limfocita T koji imaju drugu, dulju izoformu antigena CD45 (13, 14, 15, 16). Posebno važnu ulogu u obrani od infekcije imaju memorijski pomagački (CD45- R0+CD4+) limfociti, ali se prema ovom ispitivanju njihov udio nije povećao u bolesne novorođenčadi. U toj je skupini u odnosu na zdravu novorođenčad signifikantno viši, premda brojčano mali, udio stanica CD45R0+CD4- koje uključuju memorijske citotoksične limfocite, ali vrlo vjerojatno i nezrele timocite (CD4-CD8-) koji su ušli u krvotok (17, 18). Kako duljina gestacije utječe na limfocitni fenotip, a novorođenčad sa simptomima infekcije nisu bila ravnomjerno zastupljena u svim gestacijskim skupinama, nego su češće bila manje gestacijske dobi, analizirana su bolesna i zdrava djeca iste gestacijske skupine da bi se jasnije istaknuo utjecaj infekcije.
Na tablici 2. prikazani su rezultati za skupinu nedonoščadi do 32 tjedna gestacije, a na tablici 3. za nedonoščad od 32 do 37 tjedana. Terminska novorođenčad nije analizirana, jer među njima nije bilo bolesnih.
Mnoge od prije opisanih razlika uočavaju se i na tablici 2. U skupini bolesne nezrele nedonoščadi znatno je smanjen udio limfocita T, a povećan udio neobilježenih stanica, dok nije bilo razlika u zastupljenosti B-limfocita, aktiviranih T-limfocita, citotoksičnih T-limfocita s NK-biljegom i NK-stanica. Analizirajući ove dvije skupine nema razlike u postotku pomagačkih T-limfocita, dok je signifikantno manje citotoksičnih T-limfocita u skupini nedonoščadi s infekcijom. Antigen CD45R0 bio je jednako malo zastupljen na limfocitima nedonoščadi obiju skupina. Na tablici 3. uspoređeni su limfocitni fenotipovi 27-ero zdrave nedonoščadi gestacije od 32 do 37 tjedana s fenotipovima 8-ero nedonoščadi s infekcijom, jednake gestacije. Vidljivo je da postoji veća zastupljenost neobilježenih stanica u bolesne djece, ali nije bilo statistički vjerodostojnih razlika između uspoređivanih skupina, osim u postotku stanica CD4-CD8- kojih je bilo pouzdano više u bolesne djece. U skupini bolesnih je postotak T-limfocita bio niži u sva tri obilježavanja protutijelom anti-CD3, a isto tako je bio niži i postotak pomagačkih i citotoksičnih T-limfocita, ali sve bez statističke signifikantnosti. Nije bilo razlika u postotku B-limfocita i NK-stanica, dok je bilo nešto više stanica CD45R0+CD4- u skupini nedonoščadi s infekcijom. Jednako malo je bilo memorijskih pomagačkih stanica u obje skupine.
RASPRAVA
Analizirali smo limfocitni fenotip umbilikalne krvi novorođenčadi s infekcijom i zdrave novorođenčadi, i dobili znatne razlike u zastupljenosti glavnih limfocitnih populacija između bolesne i zdrave djece, koje nakon raščlanjivanja prema gestacijskoj zrelosti novorođenčadi, nisu bile evidentne za skupinu zrelije nedonoščadi kao za skupinu nezrele nedonoščadi.
Učestalo pobolijevanje novorođenčadi, a posebno nedonoščadi, od infekcija i teški oblici bolesti koji se u njih javljaju rezultat su nezrelosti imunosustava u toj životnoj dobi, kada on još nije razvio svoj puni potencijal. Prolazno i fiziološko stanje razvojne imunodeficijencije u novorođenačkoj dobi može se dijelom objasniti razlikama broja limfocita u odnosu na stariju djecu i odrasle osobe, posebno pojedinih subpopulacija limfocita, i njihovim različitim funkcioniranjem. Valja očekivati da u djece koja obole od zarazne bolesti te razlike budu izraženije. Također bi imunoreakcija na infekciju trebala uzrokovati promjene u zastupljenosti pojedinih limfocitnih subpopulacija u oboljele djece u odnosu na zdravu djecu. U tom je smislu važno određivanje postotka memorijskih pomagačkih limfocita T. Naime, prema rezultatima većeg broja radova, uz prisutnost infekcije dolazi do prijelaza naivnih u memorijske pomagačke limfocite T, koje karakterizira brži i veći proliferativni odgovor, kao i jača sekrecija nekih limfokina, koji reguliraju i sintezu imunoglobulina u limfocita B (19, 20, 21, 22).
Općenito je prihvaćeno da je zastupljenost T-limfocita u krvi novorođenčadi manja nego što je u krvi odraslih ljudi (23, 24, 25, 26). To je smanjenje ponajprije rezultat manjeg udjela citotoksičnih limfocita T, dok udio pomagačkih limfocita T odgovara onom u odraslih ljudi prema većini istraživanja (27, 28). Postotak je T-limfocita još niži u nedonoščadi nego u terminske novorođenčadi, jer se u njih smanjuje i udio pomagačkih limfocita T.
Uspoređujući u ovom istraživanju skupinu zdrave novorođenčadi sa skupinom one koja je imala znakove perinatalne infekcije odmah po rođenju (što je ukazivalo da je infekcija započela intrauterino, a možda i bila uzrokom prijevremenog poroda), može se ustvrditi da je u umbilikalnoj krvi bolesne novorođenčadi vjerodostojno niži postotak limfocita T. To je sniženje vjerodostojnije za citotoksične limfocite (p=0,001), ali je znatno i za pomagačke limfocite (p=0,013). Nije bilo razlika u postocima citotoksičnih T-limfocita s NK-biljegom, aktiviranih T-limfocita, a niti u zastupljenosti B-limfocita i NK-stanica.
Suprotno očekivanju, bolesna novorođenčad nije imala u većem postotku memorijske pomagačke limfocite T (CD45R0+CD4+), ali je u njih, premda u malom postotku, bilo znatno više stanica fenotipa CD45R0+CD4-. Taj fenotip predstavlja memorijske citotoksične limfocite (CD45R0+CD4-CD8+), ali i oblike nezrelih stanica (CD45R0+CD4-CD8-), koje su, možda zbog stanja stresa, ranije napustile timus (17, 18). Poznato je, naime, da timociti u jednom stadiju razvoja, prije procesa pozitivne i negativne selekcije, nose biljeg CD45R0, ali ga limfociti koji ulaze u cirkulaciju gube i izražavaju antigen CD45RA. Daljnja konverzija u CD45R0 trebala bi biti rezultat antigenske stimulacije i zbog toga mogući pokazatelj intrauterine infekcije (19, 20).
Da bi se razlučio utjecaj gestacijske zrelosti na limfocitni fenotip od utjecaja infekcije, analizirane su limfocitne populacije bolesne i zdrave novorođenčadi razvrstane u dvije gestacijske kategorije. [iroki raspon gestacijske zrelosti u skupini od 24 do 32 gestacijska tjedna, uz mali broj ispitanika, nije isključivao mogućnost da nešto niža gestacija oboljele djece u odnosu na zdravu u toj skupini utječe na rezultate analize.
Za bolesnu nedonoščad od 24 do 32 tjedna gestacije utvrđen je manji postotak T-limfocita, i to citotoksičnih T-limfocita, a veći postotak neobilježenih stanica. U gestacijskoj skupini od 32 do 37 tjedana nije bilo statistički signifikantnih razlika u postotku T-limfocita između bolesne i zdrave djece, makar se mogla zapaziti slična tendencija povećanja postotka neobilježenih stanica u skupini djece s infekcijom. Zastupljenost markera CD45R0 na limfocitima nezrelije, kao i zrelije nedonoščadi nije se razlikovala s obzirom na infekciju.
Zaključno se može reći da limfociti novorođenčadi sa znakovima infekcije izražavaju u manjoj mjeri antigene koji karakteriziraju zrele limfocitne populacije od zdrave novorođenčadi jednake gestacijske zrelosti. Veća zastupljenost neobilježenih stanica koja se dobila imunofenotipizacijom limfocita u bolesne djece bez obzira na primijenjenu kombinaciju monoklonskih protutijela, znači i veću prisutnost nezrelih oblika limfocita. Moguće je da su takva novorođenčad primarno sklonija infekciji ili da sama bolest dovodi do mobilizacije nezrelih stadija limfocita iz limfnog tkiva. U ovim se analizama marker CD45R0 nije istaknuo kao pokazatelj postojanja infekcije u novorođenčadi.
Ključne riječi:
Kategorija: Klinička zapažanja
Broj: Vol. 43, No 3, srpanj - rujan 1999
Autori: E. Juretić, T. Tkalčević, V. Vukelić, B. Užarević, M. Petrovečki
Referenca rada:
DOI: