Probir subtelomernih regija metodom fluorescentne in situ hibridizacije (fish) u 31-og bolesnika sa smetnjama u razvoju

U ovom radu obavljeno je ispitivanje subtelomernih regija kromosoma pomoću višebojne fluorescentne in situ hibridizacije, radi utvrđivanja učestalosti finih subtelomernih poremećaja kromosoma u našoj skupini djece sa smetnjama u razvoju. Ispitivanje je obuhvatilo 31 dijete sa zastojem u razvoju, dismorfijom i/ili kongenitalnom anomalijom i urednim citogenetičkim nalazom. Za analizu se služilo preparatima dobivenim kratkotrajnom kulturom stanica periferne krvi i višebojnim sustavom sondi DNA ToTelVysion (Vysis) za probir subtelomernih regija. Poremećaj subtelomernih regija identificiran je u 2-je (6,4%) bolesnika. Rezultati ovog ispitivanja upućuju na to da je metoda probira FISH korisna za identifikaciju poremećaja subtelomernih regija kromosoma i da submikroskopske aberacije subtelomernih regija imaju važnu ulogu u etiologiji mentalne retardacije.
Ključne riječi: GENETSKI PROBIR – metode; FLUORESCENTNA HIBRIDIZACIJA IN SITU – metode; TELOMERA – genetika; KROMOSOMSKA ABERACIJA; MENTAL RETARDATION – genetika, etiologija UVOD
Mentalna retardacija (MR) prisutna je u 1-2% opće populacije i ima štetne posljedice za oboljelog, obitelj i zajednicu. Etiologija MR-a je složena i u otprilike 50% bolesnika nepoznata. Mentalna retardacija može biti posljedica monogenskih bolesti, kromosomskih aberacija, a najče- šće je multifaktorska. Posebna pozornost u obradi bolesnika posvećuje se genetičkim ispitivanjima, u okviru kojih značajno mjesto zauzima upotreba složenih citogenetičkih postupaka (1). Tako su metodama klasične citogenetike kromosomske aberacije otkrivene u 4-34,1% bolesnika (2). Klasične metode pruga za identifikaciju kromosoma omogućuju sveobuhvatan uvid u promjene čovjekovog genoma i identifikaciju segmenata veli- čine 5-10 Mb, dok prestrukturiranje sitnijih intersticijskih ili telomernih segmenata kromosoma nije moguće otkriti ovim metodama. Stvarna uloga kromosomskih poremećaja u etiologiji mentalne retardacije zasad nije poznata. Razlog tome su ograničenja danas poznatih metoda ispitivanja i nemogućnost probira čitavog čovjekovog genoma radi detekcije submikroskopskih poremećaja i ispitivanja njihove učestalosti i kliničkog značenja. U etiologiji mentalne retardacije posebno su zanimljivi poremećaji subtelomernih regija kromosoma. To su dijelovi kromosoma bogati genima pa poremećaji u tim regijama nerijetko imaju štetne posljedice na fenotip. Molekularnim metodama ispitivanja otkrivene su promjene subtelomernih regija u 0,0-29,4% bolesnika s MR-om (2). U našoj sredini su ispitivanja subtelomernih regija kromosoma oskudna (3). U ovom smo radu smo obavili probir subtelomernih regija pomoću višebojne fluorescentne in situ hibridizacije (FISH), radi procjene učestalosti subtelomernih poremećaja kromosoma u našoj skupini djece sa smetnjama u razvoju.

BOLESNICI I METODE
Ispitivanje je obuhvatilo 31 dijete, 17 dječaka i 14 djevojčica, primljenih na obradu zbog usporenog razvoja, dismorfije i/ili kongenitalne anomalije nepoznate etiologije.
Citogenetičko ispitivanje je obavljeno na preparatima dobivenim kratkotrajnom kulturom PHA-stimuliranih limfocita periferne krvi, uz upotrebu metode za sinhronizaciju stanica. Svakom ispitaniku određen je kariotip pomoću GTG, RBG i CBG metoda identifikacije kromosoma. Kod bolesnika s klinički suspektnim mikrodelecijskim sindromom obavljeno je ispitivanje pomoću metode FISH i odgovarajuć e lokus specifične sonde.
Za probir subtelomernih regija kromosoma upotrijebljen je prije opisan postupak i višebojni sustav DNA sondi To- TelVysion (Vysis) (3). Sustav se sastoji od 15 mješavina kromosom - specifičnih subtelomernih sondi DNA i kontrolnih sondi za identifikaciju pojedinih kromosomskih tipova. U postupku pripreme preparata i hibridizacije primijenjen je modificiran postupak što ga je preporučio proizvođač. Kod bolesnika sa suspektnim poremećajem subtelomernih regija obavljeno je dodatno ispitivanje pomoću lokus- specifičnih ili DNA sondi za obiljež avanje čitavih kromosoma. Za analizu preparata upotrijebljen je fluorescencijski mikroskop AX-70 (Olympus), a rezultati hibridizacije su dokumentirani pomoću programa Isis (MetaSystems).

REZULTATI
Svi bolesnici obuhvaćeni ovim ispitivanjem imaju uredan diploidan kariotip, to znači da na razini rezolucije od 450-550 pruga nije identificiran mikroskopski vidljiv strukturni poremećaj kromosoma. Kod 7-ero bolesnika kliničkim se pregledom posumnjalo na jedan od mikrodelecijskih sindroma. Na sindrom delecije 22q posumnjalo se kod 5-ero bolesnika, kod jedne bolesnice na Smith-Magenisov sindrom i kod jedne djevojčice na Miller-Diekerov sindrom. Pomoću metode FISH i odgovarajuće lokus- specifične sonde isključene su mikrodelecije ispitanih kromosomskih lokusa i utvrđen uredan nalaz.
Kod svakog bolesnika izvršen je probir subtelomernih regija pomoću višebojnog sustava sondi DNA. Poremećaj subtelomernih kromosomskih regija identificiran je kod 2 bolesnice (6,45%), dok je kod ostalih utvrđena uredna distribucija i broj ispitanih lokusa. Kod jedne bolesnice identificiran je gubitak subtelomerne regije kratkoga kraka kromosoma 8 i prisutnost triju signala za kratki krak kromosoma 7. Dodatnom analizom bolesnice i oba roditelja, pomoću kromosom- specifičnih subtelomernih DNA sondi i DNA sondi za obilježavanje čitavih kromosoma, utvrđena je nebalansirana translokacija terminalnih segmenata kratkih krakova kromosoma 7 i 8, naslijeđena od majke. Kod drugog bolesnika je metodom probira FISH identificiran samo jedan signal za subtelomernu regiju dugoga kraka kromosoma 14, uz uredan nalaz ostalih subtelomernih regija. Dodatna analiza pomoću kromosom specifične DNA sonde potvrdila je rezultate probira. Citogenetič ko ispitivanje roditelja nije bilo moguće.

RASPRAVA
U ovom smo radu prikazali rezultate probira subtelomernih regija kromosoma pomoću višebojnog sustava sondi DNA u skupini bolesnika sa smetnjama u razvoju, dismorfijom i /ili kongenitalnom anomalijom urednog citogenetskog nalaza na razini rezolucije od 450-550 pruga. Poremeć aj subtelomernih regija otkriven je u 6,4% ispitanika. Kod jedne djevojčice aberacija je posljedica nebalansirane translokacije, a kod druge prisutan je gubitak subtelomerne regije akrocentričnog kromosoma uz uredan nalaz ostalih subtelomernih regija kromosoma. Ukoliko se broju ispitane djece pribroje i roditelji bolesnica, onda je poremećaj subtelomernih regija pomoću metode probira FISH otkriven u troje (9,1%) od 33-je ispitanika.

Rezultati ovog ispitivanja su u skladu s dosad provedenim analizama probira subtelomernih regija pomoću metode FISH (tablica 1). Frevencija otkrivenih poremećaja subtelomernih regija u bolesnika s mentalnom retardacijom vrlo je varijabilna i kreće se u rasponu od 0% do 12,5%, s prosjekom od 5,2%. Velika varijabilnost u frekvenciji poremećaja je dijelom posljedica razlika u primijenjenim kriterijima odabira bolesnika. Tako su aberacije subtelomernih regija otkrivene u 7,5% bolesnika s teškim i u samo 0,5 % bolesnika s blagim oblikom mentalne retardacije (4). D e V r i e s i s u r . upu- ćuju na važnost kliničke selekcije bolesnika, koju bi trebalo temeljiti na nalazu prenatalnog i postnatalnog zastoja u rastu, pozitivnoj obiteljskoj anamnezi te prisutnosti dviju ili više dismorfičnih crta ili kongenitalnih anomalija (20).
Premda većina autora smatra da je FISH metoda probira subtelomernih regija korisna u otkrivanju etiologije mentalne retardacije, postoje i oprečna mišljenja. J o y c e i s u r . ( 6 ) i v a n K a r - n e b e e k i s u r . (13) naglašavaju da klasična citogenetika i analize kariotipa metodama pruga visoke rezolucije može otkriti većinu finih poremećaja subtelomernih regija, te da stvarne kriptične aberacije subtelomernih regija nemaju bitniju ulogu u etiologiji mentalne retardacije. K n i g h t i s u r . , međutim, upozoravaju na ograničenja metoda klasične citogenetike (4). Analizom kromosoma na razini rezolucije od 850 pruga nije identificiran niti jedan od 22 kriptična poremećaja subtelomernih regija prije dokazana pomoć u metode FISH, dok su ciljanom citogenetskom analizom otkrivene samo 4 od 22 aberacije (4).
Na temelju rezultata ovog ispitivanja i rezultata analize drugih autora može se zaključiti da je FISH metoda probira subtelomernih regija korisna, jer omogućuje Naše ispitivanje / Our research 31 2 6,4 otkrivanje kromosomskih poremećaja koji nisu vidljivi citogenetskim metodama pruga visoke rezolucije, te da poremeć aji sitnih segmenata subtelomernih regija imaju važnu ulogu u etiologiji mentalne retardacije. Metoda probira FISH je zahtjevna metoda analize humanog genoma, koja je od praktičnog interesa u klinič koj obradi bolesnika sa smetnjama u razvoju i od znanstvenog interesa u ispitivanjima uloge specifičnih kromosomskih regija na rast i razvoj organizma.
LITERATURA

1. Barišić I, Petković I, Hećimović S. Evaluacija genetičkih uzroka mentalne retardacije. Liječ Vjesn 2003;125:71-7.
2. Xu J, Chen Z. Advances in molecular cytogenetics for the evaluation of mental retardation. Am J Med Genet 2003;117C:15-24.
3. Petković I, Barišić I. Evaluation of subtelomeric chromosome regions using multicolour FISH assay. Paediatr Croat 2003;47:1-4.
4. Knight SJL, Regan R, Nicod A, Horsley SW, Keaney L, Homfray T, Winter R, Bolton P, Flint J. Subtle chromosomal rearrangements in children with unexplained mental retardation. Lancet 1999; 354:1676-81.
5. Ballif BC, Kashork CD, Shaffer LG. The promise and pitfalls of telomere terion-specific probes. Am J Hum Genet 2000;67:1356-9.
6. Joyce CA, Dennis NR, Cooper S, Brown CE. Subtelomeric rearrangements: results from a study of selected and unselected probands with idiopathic mental retardation and control individuals by using high-resolution G-banding and FISH. Hum Genet 2001;109:440-51.
7. Rossi E, Piccini F, Zollino M, Neri G, Caselli D i sur. Cryptic telomeric rearrangements in subjects with mental retardation associated with dysmorphism and congenital malformations. J Med Genet 2001;38:417-20.
8. Riegel M, Baumer A, Jamar M, Delbecque K, Herens C, Verloes A, Schinzel A. Submicroscopic terminal deletions and duplications in retarded patients with unclassified malformation syndromes. Hum Genet 2001;109:286-94.
9. Fan YS, Zhang Y, Speevak M, Farrell S, Jung JH, Siu VM. Detection of submicroscopic aberrations in patients with unexplained mental retardation by fluorescence in situ hybridization using multiple subtelomeric probes. Genet Med 2001;3:416-21.
10. Aderlid MB, Schoumans J, Anneren G, Sahlen S, Kyllerman M i sur. Subtelomeric rearrangements detected in patients with idiopathic mental retardation. Am J Med Genet 2002;107:275-84.
11. Baker E, Hinton L, Callen DF, Altree M, Dobbie A, Eyre JH i sur. Study of 250 children with idiopathic mental retardation reveals nine cryptic and diverse subtelomeric chromosome anomalies. Am J Med Genet 2002;107:285-93.
12. Clarkson B, Pavenski K, Dupuis L, Kennedy S, Meyn S i sur. Detecting rearrangements in children using subtelomeric FISH and SKY. Am J Med Genet 2002;107:267-74.
13. Van Karnebeck CDM, Koevoets C, Sluijter S, Bijlsma EK, Smeets DFMC i sur. Prospective screening for subtelomeric rearrangemetns in children with mental retardation of unknown aetiology: the Amsterdam experience. J Med Genet 2002;39: 546-53.
14. Takacs JE, Ravnan B. Subtelomere FISH analysis in over 2000 specimens tested at Genzyme Genetics. Eur J Hum Genet 2003;suppl 1:121.
15. Erjavec-Škerget A, Zagorec A, Zagradišnik B, Kokalj-Vokač N. Subtelomeric chromosome rearrangements in mentally retarded and/or dysmorphic patients from north-eastern Slovenia. Eur J Hum Genet 2003;suppl 1:120.
16. Obersztyn E, Kutkowska-Kazmierczak A, Helias- Rodzewicz Z, Bocian E, Kostyk E i sur. Idiopathic mental retardation-results of clinical and FISH studies for subtelomeric rearrangements in 75 families. Eur J Hum Genet 2003;suppl 1:119.
17. Ehrbrecht A, Zahn S, Bosse K, Schwanitz G, Propping P, Engels H. FISH detection and characterisation of subtelomere aberrations in 76 mentally retarded patients-high diagnostic yield among midly affected patients. Eur J Hum Genet 2004;suppl 1: 127.
18. Orellana C, Monfort S, Martinez F, Badia L, Millan J, Orts A, Prieto F. Contribution of FISH to the detection of subtelomeric rearrangements in syndromic mental retardation. Eur J Hum Genet 2004; suppl 1:124.
19. Aiello V, Astolfi N, Sensi A, Neri M, Faggioli R, Mazzoni L i sur. Subtelomeric FISH screening in mental retardation: a survey report. Eur J Hum Genet 2003;suppl 1:137.
20. De Vries BBA, White SM, Knight SJL, Regan R, Homfray T, Young ID i sur. Clinical studies on submicroscopic subtelomeric rearrangements: a checklist. J Med Genet 2001;38:145-15.

Kategorija: Klinička zapažanja
Broj: Vol. 45, No 4, listopad - prosinac 2001
Autori: I. Petković, I. Barišić
Referenca rada:
DOI: